乳腺癌中淋巴管生成與SOX2和血管內皮生長因子-C的關系

韓增磊 王麗娜 孔慶暖 衛(wèi)紅軍 陳樺 黃維清

1.山東省青島市市立醫(yī)院病理科，山東青島266000；2.山東省青島市傳染病醫(yī)院檢驗科，山東青島266000

乳腺癌中淋巴管生成與SOX2和血管內皮生長因子-C的關系

韓增磊1王麗娜2孔慶暖1衛(wèi)紅軍1陳樺1黃維清1

1.山東省青島市市立醫(yī)院病理科，山東青島266000；2.山東省青島市傳染病醫(yī)院檢驗科，山東青島266000

目的探討乳腺癌中淋巴管生成與SOX2和血管內皮生長因子-C（VEGF-C）的關系，以及SOX2、VEGF-C、淋巴管生成與乳腺癌臨床病理參數的關系。方法收集青島市市立醫(yī)院病理科2013年1月～2014年4月乳腺癌組織標本90例，采用免疫組化SP法檢測各乳腺癌組織中SOX2、VEGF-C及Podoplanin的表達。比較分析不同臨床分期及病理組織學分級的乳腺癌組織中SOX2、VEGF-C及淋巴管密度值（LVD）的表達情況。結果90例乳腺癌組織中，淋巴結轉移者SOX2、VEGF-C和LVD的陽性率分別為84.62%、76.92%和61.54%，高于無淋巴結轉移者（44.00%、48.00%、32.00%），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=15.23、7.05、6.33，P=0.00、0.01、0.01）。組織學分級Ⅱ～Ⅲ級者SOX2、VEGF-C的陽性率分別為82.35%、76.47%，高于組織學分級Ⅰ級者（45.45%、45.45%），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=11.57、7.46，P=0.00、0.01）。SOX2、VEGF-C陽性者LVD陽性率分別為60.60%和61.29%，高于SOX2、VEGF-C陰性者（33.33%、35.71%），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.26、5.07，P=0.02、0.02）。SOX2陽性者VEGF-C陽性率為75.76%，高于SOX2陰性者（50.00%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.45，P=0.02）。結論SOX2、VEGF-C、LVD陽性表達提示腫瘤的高侵襲性，且三者間均存在一定的相關性。SOX2在腫瘤中可能通過促進VEGF-C分泌誘導淋巴管生成。

乳腺癌；SOX2；血管內皮生長因子-C；Podoplanin；淋巴管生成；免疫組織化學

淋巴管生成在惡性腫瘤侵襲性生長及淋巴結轉移中起著非常重要的作用，這個過程非常復雜，它與許多直接或間接的因素密切相關。podoplanin是一種淋巴管標志物，最早發(fā)現于腎小球足突細胞膜，屬于Ⅰ型黏液樣跨膜糖蛋白，一般只存在于較小的淋巴管，而不存在于大的淋巴管，如胸導管。研究已經證實，淋巴管生成與不同類型惡性腫瘤淋巴結轉移及患者預后有關［1-2］。轉錄因子SOX基因家族尤其是其重要家族成員，近幾年被廣泛關注。較多研究表明SOX2基因異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及淋巴結轉移相關［3-5］。血管內皮生長因子-C（VEGF-C）作為血管內皮生長因子家族中的一員，其促進淋巴管生成，并在惡性腫瘤淋巴結轉移中的作用也有較多的研究［6-7］。但SOX2、VEGF-C與淋巴管生成之間的相互關系未見報道。本實驗收集青島市市立醫(yī)院病理科乳腺癌90例，通過免疫組織化學SP法染色，探討乳腺癌中淋巴管生成與SOX2和VEGF-C的關系，以及SOX2、VEGF-C、淋巴管生成與乳腺癌臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2013年1月～2014年4月青島市市立醫(yī)院病理科非特殊型浸潤性乳腺癌組織標本90例，所有患者臨床資料完整，50歲及以上者62例，淋巴結轉移者65例，腫瘤的組織學分級根據SBR分級標準分為3級。

1.2 試劑

鼠抗人VEGF-C單克隆抗體、兔抗人SOX2單克隆抗體、鼠抗人podoplanin單克隆抗體、非免疫動物血清、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒及PV9000通用型標準試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

免疫組織化學SP法，組織切片常規(guī)脫蠟至水，內源性過氧化物酶阻斷，高壓熱修復，分別滴加一抗，濕盒內4℃過夜；滴加試劑1，濕盒內37℃孵育20 min，滴加試劑2，濕盒內37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封固。陰性對照采用與一抗?jié)舛认嗤耐N非免疫動物血清IgG。VEGF-C、SOX2、podoplanin采用已知陽性切片作對照。

1.4 結果判定

SOX2和VEGF-C根據陽性細胞百分比及陽性細胞染色深淺計分，①＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～100%為3分。②無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩者乘積作為判斷標準：0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9分為（+++）。≤（+）為陰性，≥（++）為陽性。

腫瘤區(qū)域內凡是podoplanin陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇不論呈腔與否均視為淋巴管，淋巴管是否成腔不作為判定標準，但淋巴管之間必須有清楚的分離。先于低倍鏡（100倍）下確定血管熱區(qū)，選定血管最密集的區(qū)域3處，在高倍鏡（400倍）下計數血管，取3個視野的均值作為淋巴管密度值（lymphatic vessel density，LVD）。取所有LVD值的中位數作為判定標準，小于中位數的為陰性，大于等于中位數的為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SOX2表達與臨床病理參數的關系

SOX2陽性部位為細胞核，著色為淺黃色至深褐色顆粒（圖1），90例乳腺癌中66例SOX2陽性，陽性率為73.3%（66/90）。不同年齡及腫瘤大小患者，其SOX2表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.70、0.81，均P＞0.05）。有淋巴結轉移者和組織學分級Ⅱ～Ⅲ級者SOX2陽性率分別為84.62%（55/65）、82.35%（56/68），高于無淋巴結轉移者和組織學分級Ⅰ級者的44.00%（11/25）、45.45%（10/22），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=15.23、11.57；P=0.00、0.00）。見表1。

2.2 VEGF-C表達與臨床病理參數的關系

VEGF-C陽性部位為細胞質，著色為淺黃色至深褐色顆粒（圖2），90例乳腺癌中62例VEGF-C陽性，不同年齡及腫瘤大小患者，其VEGF-C表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.27、1.01，均P＞0.05）。有淋巴結轉移和組織學分級Ⅱ～Ⅲ級者VEGF-C陽性率分別為76.92%（50/65）、76.47%（52/68），高于無淋巴結轉移和組織學分級Ⅰ級者的48.00%（12/25）、45.45%（10/22），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.05、7.46，P= 0.01、0.01）。見表1。

2.3 LVD與臨床病理參數的關系

Podoplanin在薄壁淋巴管結構的內皮細胞漿或成簇的內皮細胞漿內呈陽性染色，大多呈彌漫的棕黃色（圖3）。LVD值最小為0，最大為11，中位數為3.5。在90例乳腺癌中小于中位數即LVD陰性的例數為42例，大于等于中位數即LVD陽性的例數為48例。不同年齡、腫瘤大小及不同組織學分級患者，其LVD表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。有淋巴結轉移者LVD陽性率為61.54%（40/65），高于無淋巴結轉移組的陽性率［32.00%（8/25）］，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.33，P=0.01）。見表1。

2.4 SOX2、VEGF-C、LVD相互之間的關系

SOX2陽性者和VEGF-C陽性者LVD陽性率分別為60.60%（40/66）和61.29%（38/62），高于SOX2陰性者和VEGF-C陰性者的33.33%（8/24）和35.71%（10/28），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.26、5.07，P=0.02、0.02），見表2。SOX2陽性者VEGF-C陽性率為75.76%（50/66），高于SOX2陰性者的50.00%（12/ 24），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.45，P=0.02）。見表3。

3 討論

3.1 SOX2與乳腺癌臨床病理參數

SOX基因家族最早在Y染色體缺失小鼠中發(fā)現，它是具有羥甲基丁酸鈣特征性結構的編碼轉錄因子的一組基因，SOX2是其重要成員之一。近來研究表明，SOX2不但與腫瘤發(fā)生及腫瘤干細胞調控有關，而且與腫瘤侵襲性及淋巴結轉移也有一定的關系［8-10］。本研究顯示，SOX2的異常表達與患者的年齡、腫瘤大小均無關，而有淋巴結轉移組SOX2陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，且差異有統(tǒng)計學意義，這說明SOX2對腫瘤淋巴結轉移起到了促進作用，此結果與牛艷清等［11］及李景賀等［12］的研究結果一致。在本研究中，組織學分級Ⅱ級和Ⅲ級的腫瘤SOX2陽性率明顯高于組織學分級Ⅰ級者，差異有統(tǒng)計學意義，腫瘤的組織學分級越高說明腫瘤惡性度越高、侵襲性越強，由此說明SOX2陽性表達可以提示腫瘤的惡性程度更高。此結果與既往的研究結果一致［13-14］。這可能是因為SOX2作為一種干細胞轉錄因子，直接參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，在腫瘤的發(fā)生階段其高表達就決定了腫瘤的高惡性。

3.2 VEGF-C、LVD與乳腺癌臨床病理參數

VEGF家族是一組特異作用于脈管內皮細胞的生長因子，它由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD、VEGF-E、胎盤生長因子等組成。VEGF-A可以促腫瘤血管生成以及增加血管通透性，其與許多腫瘤的轉移有關。腫瘤轉移是一個復雜的過程，血管生成在腫瘤轉移中可能不是決定、甚至不是主要的作用，只是在轉移發(fā)生過程中一系列影響因素之一［15］。不應片面夸大VEGF-A的促血管形成在腫瘤淋巴轉移中的作用，而忽略淋巴管形成在腫瘤淋巴結轉移中的作用。1996年Joukov等克隆并分離出VEGF家族的新成員——VEGF-C。VEGF-C主要在淋巴管的生成中起作用，Ding等［16］在胃癌的研究中提示腫瘤細胞中VEGFC高表達會促進腫瘤的生長及轉移。本研究顯示，組織學Ⅱ級和Ⅲ級者VEGF-C陽性率明顯高于組織學Ⅰ級者，有淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移者，且差異有統(tǒng)計學意義，這提示VEGF-C也可以作為腫瘤高度侵襲性的一個篩選指標，并且與腫瘤淋巴結轉移有一定的關系，此結果與上述文獻結果一致。在本實驗中，有淋巴結轉移者LVD陽性率明顯高于無淋巴結轉移者，且差異有統(tǒng)計學意義，而且VEGF-C陽性者LVD陽性率高于VEGF-C陰性者，差異有統(tǒng)計學意義，這說明淋巴管生成不但可以促進腫瘤淋巴結轉移，而且與VEGF-C分泌具有一定的相關性，且呈正相關，這與Raica等［17］和Tammela等［18］的研究結果一致，其原因是腫瘤細胞分泌VEGF-C刺激了腫瘤中淋巴管的生成，并有可能改變淋巴管管壁通透性，從而使腫瘤細胞侵入淋巴管變得更容易，導致淋巴結轉移可能性增加。

3.3 淋巴管生成與SOX2、VEGF-C的相互關系

SOX2與VEGF-C在乳腺癌中關系的研究未見報道，在本次研究中，SOX2及VEGF-C的表達與年齡、腫瘤大小均無關，但均與組織學分級及有無淋巴結轉移相關。SOX2陽性者的VEGF-C及LVD的陽性率均高于SOX2陰性者，差異有統(tǒng)計學意義，這提示SOX2與VEGF-C和LVD有一定的相關性，SOX2的分泌對促進VEGF-C分泌及淋巴管的生成具有一定的作用，可能是腫瘤中SOX2通過某種機制調節(jié)VEGF-C的分泌，影響腫瘤中新生淋巴管生成，從而導致腫瘤淋巴結轉移。

在本次研究結果中還可以看到，LVD僅與腫瘤淋巴結轉移有關，而VEGF-C除與淋巴結轉移有關外還與組織學分級有關，猜測可能的原因是，SOX2促進VEGF-C大量分泌，VEGF-C的受體為VEGFR-2和VEGFR-3，VEGFR-2表達于血管及淋巴管內皮細胞，而VEGFR-3的表達高度限制于淋巴管內皮細胞，VEGF-C優(yōu)先與VEGFR-3結合，促進淋巴管生成，剩余的VEGF-C再與VEGFR-2結合，不僅促進淋巴管生成還促進血管生成，腫瘤中血管增多，血供豐富，為腫瘤的生長及間變提供基礎，從而引起腫瘤惡性程度增高，組織學分級增高。本研究組猜想SOX2可能與腫瘤血管生成也有一定的關系，這可以作為下一步研究的問題。

綜上所述，SOX2、VEGF-C或LVD陽性表達時腫瘤侵襲性增高，VEGF-C與LVD之間、SOX2與VEGF-C、LVD間具有一定的相關性。SOX2在腫瘤中可能通過促進VEGF-C分泌誘導淋巴管生成，從而影響腫瘤淋巴結轉移。

［1］Nakayama H，Enza H，Yasui W.Expression of podoplanin/ D2-40 in pericryptalstromal cells in superficial colorectal epithelial neoplasia［J］.Med Mol Morphol，2013，46（1）：20-23.

［2］Cao Y，Zhong W.Tumor-derived lymphangiogenic factors and lymphaticmetastasis［J］.Biomed Pharmacother，2007，61（5）：534-539.

［3］Abd EI-Maqsound NM，AbdEbd EI-Rehim DM.Clinicopathologic implications of EpCAM and SOX2 expression in breast cancer［J］.Clin Breast Cancer，2014，14（1）：11-19.

［4］Li X，Xu Y，Chen S，et al.SOX2 promotes tumor metastasis by stimulatingepithelial-to-mesenchymal transition via regulation of WNT/β-catenin signal network［J］.Cancer Lett，2013，336（2）：379-389.

［5］許森林，余時滄.SOX2參與惡性腫瘤生物學行為調控的研究進展［J］.重慶醫(yī)學，2012，41（15）：1543-1545.

［6］Achen MG，Staccker SA.Molecular control of lymphatic metastasis［J］.Ann NY Acad Sci，2008，1131：225-234.

［7］周曉琳.肝癌組織中VEGF-C及其受體flt-4的表達及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2013，29（3）：340-342.

［8］Neumann J，Bahr F，Horst D，et al.S0X2 expression correlates with lymph-nodemetastases and distant spread in right-sided colon cancer［J］.BMC Cancer，2011，11（5）：518-521.

［9］László L.Predictive and prognostric factors in the complex treatment of patients with colorectal cancer［J］.Magy Onkol，2010，54（4）：383-394.

［10］Posadas EM，Figlin RA.Understanding the role of MET kinase in cancer therapy［J］.J Clin Oncol，2013，31（2）：169-170.

［11］牛艷清，肖鵬，王云峰.非小細胞肺癌中SOX2的表達及其臨床意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30（6）：681-683.

［12］李景賀，王立萍，金立方，等.轉錄因子SOX2在人肺癌中的表達及其臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2013，17（8）：1437-1439.

［13］Huang YH，Luo MH，Ni YB，et al.Increased SOX2 expression in less differentiated breast carcinomas and their lymph node metastasis［J］.Histopathology，2014，64（4）：494-503.

［14］許偉，位云艷，譚瑤曦，等.干細胞轉錄因子SOX2在肺癌中的表達和意義［J］.中國肺癌雜志，2013，16（11）：591-595.

［15］Lymboussaki A，Partanen T，Olofsson B，et al.Expression of the vascular endothelial growth factor C receptor VEGFR-3 in lymphatic endothelium of the skin and in vascular tumors［J］.Am J Pathol，2010，193（2）：395-403.

［16］Ding S，Li C，Lin S，et al.Distinct VEGF-A and VEGF-C in tumor metastasis of gastric carcinoma［J］.Oncol Rep，2007，17（2）：369-375.

［17］Raica M，Ribatti D.Targeting tumor lymphangiogenesis：an update［J］.Curr Med Chem，2010，17（8）：698-708.

［18］TammelaT，AlitaloK.Lymphangiogenesis：molecularmechanisms and future promise［J］.Cell，2010，140（9）：460-476.

Correlations between lymphangiogenesis and SOX2,VEGF-C in breast carcinoma

HAN Zenglei1WANG Li'na2KONG Qingnuan1WEI Hongjun1CHEN Hua1HUANG Weiqing1
1.Department of Pathology,Qingdao Municipal Hospital,Shandong Province,Qingdao266000,China;2.Department of Laboratory,Qingdao Infectious Diseases Hospital,Shandong Province,Qingdao266000,China

ObjectiveTo investigate the correlations between lymphangiogenesis and SOX2,VEGF-C in breast carcinoma,and its associations with the clinical parameters of patients.MethodsImmunohistochemistry SP method was applied to detect the expression of SOX2,VEGF-C and podoplanin in 90 cases of breast carcinoma from the Department of Pathology in Qingdao Municipal Hospital from January 2013 to April 2014.The expression of SOX,VEGF-C and LVD in tissues of breast carcinoma with different clinical stage and histologic grading were compared and analyzed.ResultsIn 90 tissues of breast carcinoma,the positive rates of SOX2,VEGF-C and LVD in tissues of patients with lymph node metastasis were 84.62%,76.92 and 61.54%respectively,which were much higher than those of nonlymph-node-metastasis(44.00%,48.00%,32.00%),the differences were statistically significant(χ2=15.23,7.05,6.33;P=0.00,0.01,0.01).The positive rates of SOX2 and VEGF-C in tissues of patients with histological grade ofⅡ-Ⅲwere 82.35%and 76.47%respectively,which were much higher than 45.45%and 45.45%in patients with histological gradeⅠ,the differences were statistically significant(χ2=11.57,7.46;P=0.00,0.01).The positive rates of LVD were 60.60%and 61.29%in patients with positive expression of SOX2 and VEGF-C respectively,which were much higher than patients with negative expression of SOX2 and VEGF-C(33.33%,35.71%),the differences were statistically significant(χ2=5.26,5.07;P=0.02,0.02).The positive rates of VEGF-C was 75.76%in patients with positive expression of SOX2,which was much higher than those patients with negative expression of SOX2(50.00%),the difference was statistically significant(χ2=5.45,P＜0.05).ConclusionThe positive expression of SOX2,VEGF-C or LVD indicates highly malignant tumor and their expression levels are correlated.SOX2 may induce lymphangiogenesis by promoting the secretion of VEGF-C.

Breast carcinoma;SOX2;VEGF-C;Podoplanin;Lymphangiogenesis;Immunohistochemistry

R737.9［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0023-05

2014-11-26本文編輯：任念）

韓增磊（1976.12-），男，碩士；研究方向：病理診斷。

［作者簡介］黃維清（1966.11-），女，碩士生導師，主任醫(yī)師；研究方向：病理診斷。