手足口病患兒腸道菌群結構特征的分析

吳曉康，馬超鋒，余鵬博，陳海龍，尹佳鋒，杜毛繩，武海濱，鄧慧玲

(1.西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710004；2.西安市疾病預防控制中心，陜西 西安 710054；3.陜西省疾病預防控制中心，陜西 西安 710054；4.西安市兒童醫院，陜西 西安 710003)

手足口病患兒腸道菌群結構特征的分析

吳曉康1，馬超鋒2，余鵬博3，陳海龍2，尹佳鋒1，杜毛繩4，武海濱4，鄧慧玲4

(1.西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710004；2.西安市疾病預防控制中心，陜西 西安 710054；3.陜西省疾病預防控制中心，陜西 西安 710054；4.西安市兒童醫院，陜西 西安 710003)

目的 探索手足口病患兒腸道菌群結構特征，了解腸道菌群與疾病的相關性。方法 收集手足口病住院患兒32例和健康兒童14例糞便樣本，提取腸道菌群總脫氧核糖核酸(DNA)，16SrDNA-V3區聚合酶鏈反應(PCR)擴增，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分子指紋圖譜和測序技術，分析手足口病患兒腸道菌群組成結構、多樣性、相似性等生態學特征。結果 手足口病患兒與健康兒童相比，DGGE指紋圖譜的條帶數和Shannon-Wiener指數均顯著降低(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)，腸道菌群多樣性降低；比較兩組相似性系數和相似性系數累積曲線，手足口病患兒組內相似性降低(Z=-9.12，P<0.05)，菌群結構更趨不同；優勢條帶切膠測序結果表明，手足口病患兒以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門為主，腸道優勢菌屬可能發生變化。結論 手足口病患兒腸道菌群結構、組成發生變化，疾病的發生與腸道菌群具有一定的相關性。

手足口病；腸道菌群；變性梯度凝膠電泳；多樣性；相似性

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一種由腸道病毒引起的傳染病，多發于兒童。近年來，此病容易集中流行，輕癥患兒經治療后即可痊愈，而部分患兒出現嚴重并發癥，甚至導致死亡，已經成為威脅兒童身體健康的公共衛生問題。引起手足口病的病原主要為腸道病毒柯薩奇病毒A16型(Cox A16)和腸道病毒71型(EV71)[1]。

腸道菌群在機體代謝、免疫調節和屏障保護等起到重要作用。近來，研究發現腸道菌群結構的改變與多種疾病發生相關，如炎性腸病、肥胖、2型糖尿病、感染[2]等。有關手足口病與腸道菌群相關性的研究資料未見報道。本研究擬通過分析感染EV71病毒所致手足口病患兒腸道菌群的結構特征和組成，試圖了解疾病情況下腸道菌群是否發生變化，為進一步研究疾病發生與腸道菌群相關性提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年在西安兒童醫院住院的手足口病患兒和社區幼兒園健康兒童糞便樣本，其中手足口病患兒32份，2～6歲，男20例，女12例；健康兒童14份，3～5歲，男8例，女7例。所有患兒經西安市疾病預防控制中心病毒室病原核酸檢測均為EV71陽性，同時均符合衛生部公布的《手足口病診療指南(2010年版)》的診斷標準，采樣程序符合醫院倫理學要求。選樣標準：①近1月內未使用抗生素、益生菌或益生元等制品；②近1月內無腹瀉、痢疾、結腸炎等腸道疾病。用一次性無菌便杯收集糞便標本，密封后置冰盒中1h內運送至實驗室-80°C冰箱，備用。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗儀器

本研究采用的儀器設備有：Dcode變性梯度凝膠電泳系統、Gel DocTMXR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)、2720型聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(ABI/美國)、GeneTools圖像分析軟件，NanoPhotometerTM(德國IMPLEN公司)，-80°C低溫冰箱(DW-40L262，三洋/日本)等。

1.2.2 主要試劑

本研究采用的主要試劑有：QIAamp Stool Mini Kit(Cat.no.51504，QIAGEN公司)、Taq酶，dNTP及緩沖液(Promega公司/美國)，丙烯酰胺(Acr)，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)(Promega公司)，過硫酸銨(天津市化學試劑三廠)，TEMED(sigma公司)，去離子甲酰胺，尿素(Amresco公司)，引物合成和產物測序(上海生工)。

1.3 方法

1.3.1 腸道菌群總脫氧核糖核酸提取

參照QIAamp DNA Stool Mini Kit提取糞便樣品中菌群總脫氧核糖核酸(DNA)的步驟。提取產物用微量核酸檢測儀NanoPhotometerTM測定DNA含量。

1.3.2 聚合酶鏈反應擴增

選擇細菌16SrRNA-V3區通用引物參照El-Sayed等[3-4]設計的引物V3-F：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，V3-R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，在正向引物5′端添加40bp的GC夾，有利于產物在變性梯度凝膠電泳(DGGE)中的分析。50μL PCR反應體系包括：10×buffer 5μL，正向引物、反向引物(5μmol/L)各2μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(10mmol/L)1μL，氯化鎂(MgCl2)(2.5mmol/L)5μL，Taq DNA(5IU/μL)0.4μL，DNA模板4μL，水(H2O)30.6μL。PCR擴增程序為：采用降落聚合酶鏈反應(touchdown PCR)方案程序[3-4]，即預變性95°C 5min，95°C變性1min，退火溫度初次設定為65°C 1min，延伸65°C 1min，最后退火溫度降到55°C，在此退火溫度再進行10個循環，72°C 7min，4°C保存。PCR產物用Nano Photometer TM檢測儀測定含量。

1.3.3 指紋圖譜分析

采用DCodeTM變性梯度凝膠電泳系統對產物分析，經預試驗確定16SrDNA-V3區擴增產物最適變性梯度范圍(由上到下)為40%～75%，聚丙烯凝膠濃度為10%。取10μL擴增產物與6×上樣緩沖液混勻后加到上樣孔中，100V電壓電泳12h，溫度設置為60°C。電泳完畢后，將膠放入EB溶液(0.5g/mL)中染色20min，放置成像系統下觀察圖像并拍照保存。利用Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)分析指紋圖譜中條帶數目、灰度值，分析手足口病患兒和健康兒童腸道菌群的多樣性、相似性等。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 手足口病患兒組與健康兒童組腸道菌群多樣性分析

DGGE指紋圖譜上分離的條帶清晰可見，不同樣本的條帶呈現不同的數量、位置和亮度特征。所檢測的樣本中，條帶數范圍2～25條，其中3～9條帶較亮，圖譜可直觀清晰地反映腸道優勢菌群，見圖1。多樣性分析，兩組樣本條帶數和Shannon-Wiener指數比較，手足口病患兒組低于健康兒童組有統計學意義(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)。

2.2 手足口病患兒組與健康兒童組腸道菌群相似性分析

從圖1中可看到，兩組條帶位置分布呈現不同。采用非加權組平均法(UPGMA)，計算出Dice相似性系數，健康兒童組內個體之間相似性高于手足口病患兒組內個體之間，有統計學意義(Z=-9.12，P<0.05)，見表1，提示健康個體之間菌群組成更加相似，手足口病患兒之間菌群相對更趨于不同，菌群組成結構發生變化，所檢測樣本的聚類分析見圖2。

注：C1～C14為健康兒童組，1～32為手足口病患兒組。

圖1 手足口病患兒組和健康兒童群腸道菌群DGGE圖

Fig.1 DGGE profile of gut microbiota in HFMD group and healthy group

注：橫坐標為聚類相似度，縱坐標為樣本編號，C1～C14為健康兒童組，1～32為手足口病患兒組。

圖2 健康兒童與手足口病患兒DGGE指紋圖譜條帶聚類分析

Fig. 2 Clustering analysis of DGGE band of gut microbiota in children with HFMD and healthy children

為了比較兩組內個體之間菌群結構的相似程度，計算并繪制了兩組內個體之間的成對相似系數的累積分布曲線，見圖3，曲線反映的是相似性系數的分布特征，靠近Y軸的曲線表明有更多的相似性系數分布在低數值區，即更多的個體相互之間差異較大，腸道菌群結構相似性較低。圖中曲線表明，小于0.5的Cs值在手足口病患兒組占到總Cs值個數的97%，而健康兒童只占到64%，這個結果表明手足口病患兒菌群結果趨于不同。

2.3 變性梯度凝膠電泳指紋圖譜優勢條帶測序分析

選擇兩組DGGE圖譜上優勢條帶切膠測序，結果發現，測序結果可以看到健康兒童組以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)為主，而手足口病患兒組以厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)為主，見表2，表明兩組菌群結構發生一定的變化。

圖3 兩組內個體之間的成對相似系數的累積分布曲線

Fig.3 Accumulative distribution curves of dice similarity coefficient between two groups

表2 手足口病患兒組和健康兒童組DGGE條帶測序結果

Table 2 Sequences results of DGGE band in HFMD group and healthy group

注：從健康兒童組切膠14條，手足口病組切膠21條，*為手足口病組位置相同條帶的菌屬。

3 討論

手足口病是由腸道病毒引起的嬰幼兒常見傳染病。由于腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，近年來本病容易出現暴發和短時間內較大范圍流行。該病的發病機制目前尚不明確，有研究報道腸道病毒進入消化道后在腸黏膜內復制繁殖并持續釋放到血液，然后傳遍全身而發病，腸道黏膜是病毒入侵和增殖的主要場所[5-6]。人體腸道寄居著種類繁多、數量巨大的細菌群落，它與宿主處于共生互利的狀態，對宿主發揮著重要的生理功能，正常的腸道菌群結構可維持和增強腸道黏膜屏障功能，還能夠對抗外源性致病菌的定值和入侵，即腸道菌群的生物拮抗作用。

3.1 手足口病患兒腸道菌群多樣性特征分析

本研究則通過比較手足口病患兒與健康兒童腸道菌群結構及組成差異，探討是否因為腸道菌群結構和組成的變化，導致腸道黏膜屏障功能的降低，而促進疾病的發生。研究結果顯示手足口病患兒腸道菌群與健康兒童比較存在一定的差異。

從腸道菌群的多樣性上比較，患兒腸道菌群多樣性降低，分析其原因可能是病毒侵襲腸道黏膜，改變其腸道生態環境，造成菌群結構發生改變，多樣性降低。尹斐弘和楊娟等[6-7]發現重癥手足口病患兒血漿內毒素、二胺氧化酶和D-乳酸水平等指標均高于正常兒童，認為重癥手足口病存在黏膜屏障功能的損傷，同時腸道毒素等代謝產物入血造成內毒素血癥。

3.2 手足口病患兒腸道菌群相似性特征分析

從兩組兒童腸道菌群的相似性分析上，通過組內相似性的比較和相似性系數累積曲線可以看到，手足口病患兒組內相似性降低，腸道菌群更趨于不同，即在腸道菌群多樣性降低的情況下，菌群的種類也發生改變，此結果反映出患兒腸道菌群結構發生變化。Wang等[2]研究呼吸道流感病毒感染導致腸道炎癥發生的免疫學機制發現，在小鼠流感疾病發生過程中，腸道黏膜中有大量促炎癥的Th17細胞聚集，當抑制Th17細胞來源的IL-17A的功能，可顯著減輕腸道炎癥損傷的程度；同時，小鼠腸道菌群的組成在流感疾病發生過程中也發生了改變，采用抗生素清除腸道細菌，能夠顯著地抑制Th17細胞的聚集并減輕腸道炎癥損傷，這表明腸道菌群的改變與Th17細胞的產生之間存在聯系。筆者認為是否存在相類似的機制，手足口病患兒感染腸道病毒EV71后，引起腸道菌群組成的改變，進而引起腸道及全身性炎癥反應，具有重要的研究價值。

3.3 手足口病患兒腸道優勢菌屬分析

對指紋圖譜優勢條帶切膠測序也發現手足口病患兒腸道優勢菌屬組成發生變化。健康兒童以Bacteroidetes菌門Bacteroides屬為主要組成，而患兒以Firmicutes、Actino￣bacteria、Proteobacteria菌門為主要組成，兩組存在明顯不同。菌屬組成的不同對宿主腸道黏膜屏障功能起到不同的作用。黃永坤[5]研究表明，腸道菌群中的雙歧桿菌、乳酸桿菌等及代謝產物通過對腸上皮細胞的營養而產生促進增殖的作用，還可通過受體調節機制促進腸道黏蛋白的分泌，阻止病原體與腸上皮細胞的結合，對維護黏液層屏障功能的穩定有重要意義。

總之，腸道菌群和腸道黏膜屏障與疾病和健康有著密切的關系，通過全面深入的研究腸道菌群與手足口病的關系，將有利于進一步探索手足口病的發病機制，為尋找手足口病治療新靶點提供依據。

[1]Liu C C, Chow Y H, Chong P. Prospect and challenges for the development of multivalent vaccines against hand, foot and mouth diseases[J].Vaccine,2014,32(47):6177-6182.

[2] Wang Jian, Li Feng-qi,Wei Hai-ming,etal. Respiratory influenza virus infection induces intestinal immune injury via microbiota-mediated Th17 cell-dependent inflammation[J].The Journal of Experimental Medicine,2014,211(12):2397-2410.

[3]El-Sayed W S, Ibrahim R A. Diversity and phylogenetic analysis of endosymbiotic bacteria of the date palm root borer Oryctes agamemnon (Coleoptera: Scarabaeidae)[J].BMC Microbio-logy,2015,15:88.

[4]García-Amado M A, Bozo-Hurtado L, Astor Y,etal. Denaturing gradient gel electrophoresis analyses of the vertical distribution and diversity of Vibrio spp. populations in the Cariaco Basin[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,77(2):347-356.

[5]黃永坤.胃腸黏膜屏障功能障礙及腸道細菌或內毒素移位對機體的影響[J].臨床兒科雜志,2010,28(10):908-911.

[6]尹斐弘,鄭躍杰.兒童重癥手足口病腸道菌群和腸道黏膜通透性的研究進展[J].中國微生態學雜志,2013,25(10):1236-1239.

[7]楊娟,黃永坤,王美芬,等.不同類型手足口病患兒腸黏膜屏障功能測定的臨床意義[J].實用兒科臨床雜志,2010,25(10):731-732.

[專業責任編輯：程 茜]

Construction characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease

WU Xiao-kang1,MA Chao-feng2, YU Peng-bo3, CHEN Hai-long2,YIN Jia-feng1, DU Mao-sheng4, WU Hai-bin4, DENG Hui-ling4

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofHealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710004,China；2.CenterforDiseaseControlandPreventionofXi’an,ShaanxiXi’an710054,China；3.CenterforDiseaseControlandPreventionofShaanxi,ShaanxiXi’an710054,China；4.Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To explore the characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease (HFMD) and investigate the correlation between gut microbiota and the disease. Methods Bacterial DNAs were extracted from the faecal samples of 32 patient children with HFMD and 14 healthy children, and PCR amplification was performed at 16SrDNA-V. Finger printing and sequencing of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) were used to analyze the composition, diversity and similarity of gut microbiota in patients with HFMD. Results Compared to healthy children, the number of DGGE bands and the Shannon-Wiener index of patients with HFMD were both significantly declined (tvalue was 3.92 and 3.24, respectively, bothP<0.05), and the diversity of gut microbiota decreased. Comparison of the similarity coefficient and the accumulative distribution curves of dice similarity coefficient of both groups indicated that the similarity in HFMD group was declining (Z=-9.12,P<0.05), and the construction of gut microbiota was different. The results of splitting predominant gel bands and sequencing also revealed that Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes were mainly represented in patients with HFMD, and that the dominant bacterial genera might change. Conclusion The composition and construction of gut microbiota in patients with HFMD have changed, which suggests that the occurrence of the disease has the correlation with gut microbiota.

hand-foot-mouth disease (HFMD); gut microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity; similarity

2015-04-18

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目；陜西省科學技術研究發展資助項目(2011K12-82)；西安市科學技術局醫療衛生研究資助項目(SF1208)；國家科技重大專項《病毒性傳染病病原譜流行規律及變異研究》資助項目(2013ZX10004202)

吳曉康(1977-)，男，助理研究員，博士，主要從事腸道菌群與疾病相關性研究。

鄧慧玲，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.002

R378；R725.1

A

1673-5293(2015)04-0660-03