熒光聚合酶鏈反應定量檢測丙型肝炎患者血清中的HCV RNA及其意義

郝冬翠

（吉林省吉林市傳染病醫院，吉林 吉林 132002）

熒光聚合酶鏈反應定量檢測丙型肝炎患者血清中的HCV RNA及其意義

郝冬翠

（吉林省吉林市傳染病醫院，吉林 吉林 132002）

目的 探討定量檢測丙型肝炎患者血清中HCV RNA與急、慢性病毒性肝炎和肝纖維化等疾病之間的關系，分析其與血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平之間的關系。方法 在本組試驗中，主要采用熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法，以我院收治的103例不同臨床類型的丙型肝炎患者為研究對象，對其血清中的HCV RNA進行定量檢驗。結果 無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量顯著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 血液中HCV RNA的檢測已成為HCV感染診斷，是丙型肝炎患者病毒藥物治療療效監測及血液篩查的重要手段。在肝損害和肝臟疾病進展過程中，高水平HCV RNA發揮著重要的作用。

熒光聚合酶鏈反應；定量檢測；丙型肝炎；血清；HCV RNA；意義

全球慢性丙型肝炎病毒感染者1.7～2.0億，其中我國的感染者已超過0.4億，人群感染率約為3.2%。由此可見慢性丙型病毒性肝炎已成為我國嚴重的社會和公共衛生問題[1]。本組實驗對丙型肝炎患者血清中HCV RNA含量與疾病程度、血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平之間的關系進行研究，現進行如下報道。

1　資料與方法

1.1臨床資料：選取2013年1月至2014年6月，在我院接診103例丙型肝炎患者作為主要研究對象，通過對患者進行調查和了解，男性患者63例，女性患者40例，年齡在20～65歲，平均年齡為（43.41±1.65）歲。其中62例患者有輸血史，根據全國肝炎會議制定的臨床診斷標準，沒有癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者11例，急性肝炎23例，慢性肝炎58例，肝硬化巧11例。以上的病例中甲型肝炎、戊型肝炎病毒、乙型肝炎標志均未陰性，進行常規收集血清標本，將其置于-20 ℃的位置，對其進行統一檢測。在進行血清采集之前，103例病例均未接受干擾素等抗病毒的治療。

1.2方法：熒光PCR檢測HCV-RNA的主要原理是通過熒光能量進行傳遞，并在此基礎上，對兩條互補配對的核昔酸的雙鏈結構進行檢驗。通過對設計的雙鏈信號引物的互補鏈進行研究，兩條互補的鏈分別標記著熒光受體和供體，此信號的引物處于兩條互補雙鏈的結構之中，在此基礎上，熒光能量起著傳遞的作用，并在熒光的受體和供體之間傳遞，從而會形成相應的熒光。PCR將會重復循環進行，隨著變化信號引物的雙鏈互補結構將被分開，其中一條鏈會參與產物的合成，并成為產物合成的一部分，同時熒光會隨著雙鏈互補結構的分開而消失[2]。在整體過程中，熒光的強度會發生相應的變化，隨著我熒光強度的逐漸變化，其變化情況與反應中特異性擴增產物的量成比例關系。同時可根據純化HCV-RNA建立標準曲線，通過計算機軟件可計算出樣品中HCV-RNA的含量[3]。

在本組實驗進行檢驗過程中，主要采用美國（ABI）公司的7300熒光定量PCR檢測系統。它是一種結合熒光探針的擴增檢測技術，通過熒光信號的變化檢測丙肝病毒RNA，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程，最后通過校正曲線對未知模板進行定量分析。主要的試劑有HCV RNA陽性標準、熒光代R擴增引物、AMV逆轉錄酶、Taq-DNA聚合酶，HCV RNA陽性標準屬于純化的病毒RNA，將其置于-70 ℃保存。試驗需要設立陽性、空白、陰性、峰值對照，計算每份標本兩孔的均值。

1.3統計學分析：本次研究中，選擇統計學軟件SPSS15.0進行統計數據分析，其中計數資料以n/%形式表示，采用卡方（χ2）對計數資料進行檢驗，計量資料以（）形式表式，采用（t）對計量資料進行檢驗，如P＜0.05，則表示差異有統計學意義。

2　結 果

103例丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在103～109拷貝/mL，無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量范圍在105.1～101.8拷貝/mL，急性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.4～102.4拷貝/mL，慢性肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.6～102.5拷貝/mL，慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.8～103.0拷貝/mL。無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量顯著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者。差異具有統計學意義（P＜0.05）。急性肝炎的HCV RNA水平低于慢性丙型肝炎，差異不明顯無統計學意義。

3　討 論

丙型肝炎病毒（HCV）主要指存在脂質外膜的單正鏈RNA病毒，其可引起腸道外感染，脂質外膜的單正鏈RNA病毒已經成為非甲非乙型肝炎的主要致病因子[4]。在通常情況下，丙型肝炎病毒中基因含量在血清中較低，一般常規的臨床檢測技術很難檢驗出來，當前通過應用自聚合酶鏈反應（PCR）技術方法進行檢測，檢測HCV RNA是顯示HCV感染的一個可靠方法，也是HCV感染的最特異性檢測，此方法為丙型肝炎病毒感染的診斷提供了有效的依據。

本組試驗主要采用巢式擴增和雙鏈引物，特異性得到明顯的增高，在整個檢驗的過程中，需要再半封閉的環境下進行，同時不需要電泳分析，這樣將在一定程度上減少了認為誤差和交叉污染的機會。熒光PCR是具有較高的靈敏度、特異性的一項HCV RNA定量檢測技術，同時模板提取及逆轉錄的效率直接提高了結果的準確性[5]。本組試驗結果顯示慢性丙型肝炎、急性丙型肝炎、肝硬化患者血清中的HCV RNA含量均高于無癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者，表明在肝損害和肝臟疾病中，高水平的病毒復制可能發揮著重要的作用[6]，其中無癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）所導致的肝細胞損害，在丙型肝炎發病機制中可能是很重要的一個方面。

[1]亓文騫.脾動脈栓塞對丙型肝炎肝硬化患者脾功能亢進的療效及其在Peg-IFNα-2a抗病毒治療中的應用價值探討[D].長春：吉林大學，2010.

[2]吳大先，劉菲，劉洪波，等.轉錄介導擴增技術檢測慢性丙型肝炎患者血清中HCVRNA及與RT-PCR的比較[J].中南大學學報（醫學版)，2014，23（7)：664-672.

[3]范公忍，陳天寶，李冰，等.兩種核酸提取方法對丙型肝炎病毒RNA檢測效果的比較及應用評價[J].檢驗醫學與臨床，2015，11（1)：48-50.

[4]徐孝東.HCVF蛋白及HLA-DPA1/B1基因多態性與HCV感染慢性化和轉歸關系的研究[D].南京：南京醫科大學，2014.

[5]吳大先，劉菲，劉洪波，等.轉錄介導擴增技術檢測慢性丙型肝炎患者血清中HCVRNA及與RT-PCR的比較[J].中南大學學報（醫學版)，2014，25（7)：664-672.

[6]張復春，唐小平，蔡曉莉，等.丙型肝炎病毒基因型與血清HCVRNA含量關系及其與干擾素應答的研究.中華微生物學和免疫學雜志，2012，18（3)：131-135.

R512.6+3

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1671-8194（2015）25-0118-02