慢病毒介導Nrp1過表達促進卵巢癌細胞增殖

張 燕，滕 月，張 鍵，李 婧，李 旭

(西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心，陜西 西安 710061)

慢病毒介導Nrp1過表達促進卵巢癌細胞增殖

張 燕，滕 月，張 鍵，李 婧，李 旭

(西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心，陜西 西安 710061)

目的 研究神經纖毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)在卵巢癌中的作用，探討其作為治療靶點的可行性。方法 克隆Nrp1基因，采用慢病毒包裝體系包裝過表達Nrp1的重組慢病毒，感染卵巢癌SKOV3細胞，嘌呤霉素篩選穩定高表達Nrp1的SKOV3細胞，通過細胞計數檢測其增殖能力的改變。結果 成功包裝了過表達Nrp1重組慢病毒，篩選得到了穩定高表達Nrp1的SKOV3細胞，其增殖能力顯著高于對照細胞(t>t0.05(4)，P<0.05)。結論 Nrp1促進卵巢癌SKOV3細胞增殖，可能在卵巢癌發生發展過程中起促進作用。

卵巢癌；神經纖毛蛋白1；慢病毒；細胞增殖

卵巢癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌和宮體癌，居于第3位[1]。由于其發病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，70%以上的患者初診時已屬晚期，治療及預后效果極差，致死率居各類婦科惡性腫瘤首位[2]。因此，探尋卵巢癌發生發展過程中的關鍵分子，對于開發卵巢癌靶向治療藥物具有非常重要的意義[3]。神經纖毛蛋白1 (neuropilin 1，Nrp1)是一種單次跨膜糖蛋白，是神經軸突蛋白3家族(semaphorins 3，Sema3s) 和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族的共同受體[4]。Nrp1胞內段無功能結構域，不具備激酶活性，與配體結合后需再與神經叢蛋白Plexins或血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)結合形成三體復合物，介導活化信號向下游傳遞[5]。Nrp1可與多個配體相互作用，發揮多種功能，涉及神經調節、免疫調節、腫瘤發生[6]。目前已有多個研究小組報道了Nrp1在非小細胞肺癌[7]、乳腺癌[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]、結腸癌[11]、前列腺癌[12]等腫瘤中的重要作用，但未見Nrp1在卵巢癌中作用的相關報道。本研究擬包裝過表達Nrp1的慢病毒，利用其感染卵巢癌細胞，建立穩定高表達Nrp1的卵巢癌細胞系，檢測Nrp1過表達后卵巢癌細胞增殖能力的改變。本研究為進一步研究Nrp1在卵巢癌中的重要作用提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢癌細胞系SKOV3為本實驗室保存；Trizol購自于美國Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑、高保真Taq酶、pMD18-T載體購自于日本TaKaRa公司；多聚酶鏈反應(polymerase chain peaction PCR)擴增引物購自于上海生工生物工程公司；兔抗Nrp1抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

SKOV3細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，培養條件為37℃、5% CO2，每隔2天傳代1次。

1.2.2 組織總RNA提取

取小鼠腦組織0.1g，加Trizol 1mL，冰中勻漿后轉移至1.5mL離心管中。4℃下12 000rpm離心15min，轉移上清加入200μL氯仿進行萃取，轉移上層無色水相層加500μL異丙醇，沉淀用75%乙醇洗滌，晾干后溶于30μL DEPC水中。

1.2.3 RNA反轉錄

取總RNA 1μg加入oligo(dT)152μL，70℃溫育10min。25μL反應體系中加5×buffer 5μL、10mM dNTP 2.5μL、AMV 1μL，42℃下孵育1h。95℃ 5min終止反應。

1.2.4 PCR分段擴增神經纖毛蛋白1

200μL反應體系中加cDNA模板2μL、10mM dNTP 0.5μL、10mM上下游引物各0.5μL、10 Buffer 2μL、高保真Taq酶2U。引物序列見表1。擴增產物回收后溶于30μL TE中，進行補“A”反應。

1.2.5 連接T載體

補“A”產物回收后與pMD18-T載體連接，連接體系為10μL，16℃反應過夜，次日轉化大腸桿菌DH5α。挑選克隆，對于Nrp1上段(U)、中段(M)、下段(D)分別進行HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI酶切，鑒定目的片段是否插入pMD18-T載體中。將陽性克隆送上海生工測序，序列正確的陽性克隆分別命名為U-pMD18-T、M-pMD18-T、D-pMD18-T。

1.2.6 亞克隆

用SspI/XbaI將M-pMD18-T中的Nrp1中段切下來，連接入同樣酶切過的U-pMD18-T，構建成為U/M-pMD18-T。將PvuII/EcoRI將D-pMD18-T中的Nrp1下段切下來，連接入同樣酶切過的U/M-pMD18-T，構建成為Nrp1-pMD18-T，PCR及測序鑒定。將Nrp1序列亞克隆至病毒骨架載體，酶切鑒定。

1.2.7 包裝病毒

將3×105個HEK293FT細胞種于10cm平皿中，細胞密度達到80%時，將9μg pRRLsin-Nrp1、9μg p△R與3μg VSVG質粒共同轉染入細胞中，12h后換新鮮培養基。24h后收集細胞培養上清，用0.45μm的濾膜過濾，此即為制備好的重組慢病毒。

1.2.8 感染SKOV3細胞建立穩定細胞系

將病毒原液加入50%～60%密度的SKOV3細胞，48h后將培養液更新為含5μg/mL嘌呤霉素新鮮培養基，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，檢測感染效率。每隔2天換液一次，直至單克隆產生。挑取單克隆，鑒定后進行擴大培養。

1.2.9 蛋白表達驗證

細胞經PBS漂洗后加入預冷的細胞裂解液，用細胞刮刀將細胞刮下來，冰浴30min讓細胞充分裂解，離心后取上清。BCA法定量后進行SDS-PAGE，結束后將膠從電泳槽取出，與NC膜一起放在轉移緩沖液浸泡10min，按順序將濾紙、膠、NC膜放入轉移夾子中安裝入槽，轉移3h后取出NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，用適當比例Nrp一抗或GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后用適當比例二抗室溫孵育1h，洗膜3次后化學發光。

1.2.10 測定細胞增殖能力

將對照細胞和1#克隆細胞分別種入96孔板中，每孔5×103個，設5個復孔。每隔24h消化細胞，用Countess細胞計數儀計數，連續計數5天。

表1 Nrp1基因分段PCR擴增引物序列

Table 1 PCR amplication primer sequences for Nrp1 gene

2 結果

2.1 PCR分段擴增神經纖毛蛋白1上段、中段、下段3個片段

Nrp1基因全長2 772bp，長度過長，難于一次性擴增出來。我們采取分段PCR的策略，在Nrp1基因內部找出限制性酶切位點SspI和PvuII，將Nrp1分為3段，上段(U)大小為1 055bp、中段(D)大小為712bp、下段(D)為1 007bp，分別進行PCR。結果如圖1所示，PCR增出的條帶大小與預期的一致,見圖1。

注：1：為上段引物擴增產物；2：為中段引物擴增產物；3：為下段引物擴增產物。

圖1 PCR分段擴增Nrp1基因

Fig.1 PCR amplication of Nrp1 gene

2.2 構建神經纖毛蛋白1重組骨架載體

分別將3個片段連接至T載體，并分別采用HindⅢ/SalI、SalI/XbaI、XbaI/EcoRI雙酶切進行鑒定。與預期一致，切出了大小約為1 000、700和1 000bp的條帶，見圖2，采取1號克隆進行測序分析，其條帶確定為U、M和D。

依次將M、D切下連接至U-pMD18-T，構建為Nrp1-pMD18-T，PCR鑒定結果如圖3所示，利用U上游引物/D下游引物可擴增出陽性條帶，且條帶大小在2 000bp以上。經測序，所得序列確定為Nrp1基因序列，且3段之間無間隔或插入序列。最后將Nrp1切下連接至病毒骨架載體，HindIII/EcoRI酶切鑒定結果如圖3所示，1號克隆片段大小與預期一致，為陽性克隆。

圖2 酶切鑒定重組pMD-18T載體

Fig.2 Restriction enzyme identification of recombinant pMD-18T

注：A為HindⅢ/SalI酶切鑒定重組載體U-pMD-18T,1～5為不同克隆；B為SalI/XbaI酶切鑒定重組載體M-pMD-18T，1～5為不同克隆；C為XbaI/EcoRI酶切鑒定載體D-pMD-18T，1～4為不同克隆。

2.3 穩定過表達神經纖毛蛋白1慢病毒的包裝

共轉染病毒包裝質粒至293FT細胞中，24h后如圖4所示，幾乎所有細胞都表達綠色熒光蛋白，預計病毒包裝情況良好。收集含病毒的培養上清，感染SKOV3細胞，48h后約30%細胞為陽性，該陽性細胞為成功感染Nrp1過表達慢病毒的SKOV3細胞。嘌呤霉素壓力篩選21天后單克隆形成，擴大培養2個單克隆，經RT-PCR鑒定，該克隆的Nrp1 mRNA水平明顯高于對照細胞。Western實驗用抗Nrp1的抗體檢測出了特異性條帶，相對分子質量約為120kD，見圖5，以上結果證明，篩選得到的2個穩定克隆的Nrp1的表達水平均高于對照細胞。

注：A為RT-PCR鑒定重組Nrp1-pMD-18T載體；B為HindⅢ/EcoRI酶切鑒定Nrp1重組骨架載體，1～3為不同克隆

圖3 Nrp1重組骨架載體的構建

Fig.3 Construction of Nrp1 recombinant skeleton vector

2.4 細胞增殖能力檢測

再采用細胞計數方法檢測過表達Nrp1對卵巢癌細胞SKOV3細胞增殖能力的影響。實驗結果表明，兩組細胞在第3天起細胞數目產生顯著差異(t>t0.05(4)，P<0.05)，穩定過表達Nrp1的SKOV3細胞與對照細胞相比，細胞數目為對照細胞的2倍，且差異一直持續到第5天，表明穩定過表達Nrp1導致細胞增殖能力變強，見圖6。

注：A為共轉染293FT細胞24h后明視野；B為共轉染293FT細胞24h后GFP陽性細胞；C為感染SKOV3細胞48h后明視野；D為感染SKOV3細胞48h后GFP陽性細胞 。

圖4 Nrp1過表達慢病毒的包裝

Fig.4 Package of lentivirus overexpressing Nrp1

注：A為mRNA水平；B為蛋白水平。

圖5 穩定高表達Nrp1細胞克隆的鑒定

Fig.5 Identification of stable overexpressing Nrp1 cell clones

圖6 過表達Nrp1細胞與對照細胞增殖能力比較

Fig.6 Comparison of proliferation between overexpressing Nrp1 cells and control cells

3 討論

3.1 神經纖毛蛋白1的研究現狀

Nrp1是一種多功能受體。作為plexin的共受體，參與神經細胞導向和軸突生長的調控[4]；作為VEGFR的共受體，參與調控內皮細胞活化、增殖和遷移[6]；近期研究發現，Nrp1介導獨立的信號通路，參與多種腫瘤的發生與發展[5]。由于其分布特點和多配體結合模式，Nrp1在腫瘤中的作用機制非常復雜。Nrp1既分布于腫瘤血管內皮細胞上，也直接分布于腫瘤細胞上，在這兩個部位分別發生作用。Nrp1的兩種配體Sema家族和VEGF家族呈拮抗作用[6]，導致Nrp1在不同情況下發揮不同的功能。Chu等[13]發現Nrp1通過激活NFκB促進上皮-間質轉化，與人口腔鱗癌較差的預后相關。Chaudhary等[14]發現Sema3F通過與乳腺癌細胞表面Nrp1結合，抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)介導的乳腺癌細胞與基質的粘附，減少乳腺癌細胞播散。

3.2 慢病毒介導的基因過表達載體系統相比其他載體系統的優越性

慢病毒是一種高效的轉基因病毒載體，感染靶細胞后不會感染其他細胞，也不會在宿主細胞內部產生新的病毒顆粒。與腺病毒和逆轉錄病毒等其他病毒載體相比，具備很多優點：如能夠整合于宿主基因組中穩定長時間表達；能夠感染非分裂細胞；組織嗜性廣泛；感染后不表達病毒蛋白，細胞毒性小，宿主細胞免疫反應小等。慢病毒載體以其優越的基因轉導能力現已成為研究者最為常用的基因修飾工具。

目前有多個研究都報道了Nrp1在多種腫瘤中的表達和作用，但Nrp1在卵巢中的作用尚不明確。本研究采用慢病毒包裝系統，包裝能夠過表達Nrp1的重組慢病毒，通過慢病毒感染，建立穩定高表達Nrp1的SKOV3卵巢癌細胞系，比較過表達Nrp1后細胞增殖能力的差異。本研究初步證明Nrp1可以促進SKOV3卵巢癌細胞的增殖，初步揭示了Nrp1促進卵巢癌發生發展的作用，為進一步明確Nrp1在卵巢癌中的作用提供了實驗基礎。

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[專業責任編輯：張忠明]

Lentivirus-mediated Nrp1 overexpression promotes the proliferation of ovarian cancer cells

ZHANG Yan，TENG Yue,ZHANG Jian, LI Jing,LI Xu

(CenterforTranslationalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To study the function of neuropilin 1 (Nrp1) in ovarian cancer and the possibility of Nrp1 as therapeutic target. Methods Nrp 1 gene was cloned, and Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was packed. After infection of SKOV3 ovarian cancer cells, puromycin selection generated the stable cell clones overexpressing Nrp 1. Cell number counting assay was performed to detect the cell proliferation. Results Nrp 1 overexpressing recombinant lentivirus was successfully packed. The stable SKOV3 cell clones overexpressing Nrp 1 was selected, and it had more powerful proliferation ability than control cells (t>t0.05(4),P<0.05).Conclusion Nrp1 promotes the proliferation of SKOV3 cells, and may stimulate the progression of ovarian cancer.

ovarian cancer; neuropilin 1(Nrp1); lentivirus; cell proliferation

2015-06-18

張 燕(1981-)，女，助理研究員，醫學博士，主要從事卵巢癌分子機制研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.017

R349.82

A

1673-5293(2015)04-0706-04

李 旭，教授。

[作者簡介]滕 月(1983-)，女，助理研究員，醫學博士，主要從事卵巢癌分子機制研究(共同第一作者)。