GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

陳良鳳，張 穎，王仲奇，邸 曼，鄭福利，王 建

(1.第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032；2.安康市中心醫院婦產科，陜西 安康 725000；3.解放軍第三二三醫院婦產科，陜西 西安 710054；4.陜西中醫學院第二附屬醫院婦產科，陜西 咸陽 712000)

GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216在宮頸癌組織中的表達及臨床意義

陳良鳳1，2，張 穎1，3，王仲奇2，邸 曼1，鄭福利4，王 建1

(1.第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032；2.安康市中心醫院婦產科，陜西 安康 725000；3.解放軍第三二三醫院婦產科，陜西 西安 710054；4.陜西中醫學院第二附屬醫院婦產科，陜西 咸陽 712000)

目的 檢測糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達水平在宮頸癌組織中的表達情況及其與臨床病理因素的相關性。方法 收集2012年1月至2014年12月間第四軍醫大學西京醫院婦產科收治的宮頸鱗癌病理標本80例，采用免疫組化SP法對宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達水平進行檢測，并分析GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達與臨床病理因素之間關系。結果 宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達陽性率分別為18.8%、68.8%和12.5%。早期宮頸癌患者中GSK3β和p-GSK3βTyr216表達顯著高于中晚期宮頸癌患者(25.5% vs. 4.0%，χ2=5.193，P=0.029；76.4% vs 52.0%，χ2=4.749，P=0.039)，早期宮頸癌患者中p-GSK3βser9表達顯著低于中晚期宮頸癌患者(5.5% vs. 28.0%，χ2=7.988，P=0.009)。在宮頸癌組織中隨著細胞學分級的降低，p-GSK3βser9陽性率也隨之升高(7.4%、7.9%和33.3%，χ2=7.329，P=0.031)。淋巴結轉移陽性的宮頸癌患者中GSK3β和p-GSK3βTyr216表達均顯著低于淋巴結轉移陰性的宮頸癌患者(5.9% vs. 28.3%，χ2=6.427，P=0.018；52.9% vs. 80.4%，χ2=6.878，P=0.014)，p-GSK3βser9在淋巴結轉移陽性的宮頸癌患者中表達顯著高于淋巴結轉移陰性的宮頸癌患者(23.5% vs. 4.3%，χ2=6.577，P=0.015)。結論 宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達與宮頸癌臨床分期、細胞學分級和淋巴結轉移相關，提示GSK3β基因可能在宮頸癌組織發生發展中發揮重要作用。

宮頸；腫瘤；糖原合成酶激酶3β；免疫組織化學

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，我國作為發展中國家，宮頸癌發病率高居世界第2位，近年來宮頸癌粗發病率以平均每年8.7%的速度呈逐年上升趨勢，發病年輕化趨勢明顯[1-2]。由此可見，我國宮頸癌造成的疾病負擔和經濟負擔日益嚴重，防治形勢十分嚴峻。目前宮頸癌的具體發病機制仍不清楚，尋找宮頸癌發生發展中的關鍵基因一直以來都是研究熱點。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)是絲氨酸/蘇氨酸家族激酶GSK3的兩個亞型之一，編碼433個氨基酸，包括3個結構域，可通過參與Wnt、Akt、Hedgehoog等多種信號通路，對細胞周期、細胞凋亡、細胞侵襲/轉移、糖代謝、血管生成等多個重要生物學活動進行調控[3-4]。GSK3β生物學功能強大，被公認是信號轉導通路中決定細胞命運的關鍵激酶，一直以來都是腫瘤領域的研究熱點。磷酸化位點活化是GSK3β活性調控的主要方式之一。GSK3β基因的ser9位點磷酸化可使GSK3β功能失活，Tyr216位點磷酸化則可激活GSK3β的功能。本研究中利用免疫組化探討宮頸病變及宮頸癌組織中的GSK3β表達情況及其磷酸化水平，對于深入理解GSK3β在宮頸癌的發生發展中所扮演角色具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012年1月至2014年12月間第四軍醫大學西京醫院婦產科收治的宮頸鱗癌病理標本80例。病例納入標準為：①初次診治宮頸鱗癌患者，術前未經任何治療；②經組織病理學明確診斷為宮頸鱗癌；③臨床資料完整。所有病例病理切片均經過常規光鏡觀察，重新復核診斷。詳細記錄宮頸癌患者的癥狀體征、病理類型、細胞學分級、臨床分期、淋巴結轉移及宮旁浸潤情況、術后治療及隨訪等臨床資料并進行統計分析。

1.2 免疫組化方法

采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法(Streptavdin-Peroxidase，SP)對宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216進行檢測。小鼠抗人GSK3β、p-GSK3βser9、p-GSK3βTyr216單克隆抗體購自美國CST公司，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。將組織蠟塊連續切片為4μm，60℃烤箱加熱烤片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，按照說明書常規進行SP法免疫組化，GSK3β、GSK3βser9、GSK3βTyr216單克隆抗體使用濃度均為1:1 000，抗小鼠二抗使用濃度為1:200。采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化結果判讀

免疫組化結果由兩位經驗豐富的病理科醫生在不清楚患者臨床資料的情況下分別獨立完成判讀。隨機選擇5個視野，顯微鏡下細胞中出現棕黃色或棕褐色顆粒為表達陽性。

1.4 統計學方法

依據患者臨床病理因素對照GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216染色結果，采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，分組資料之間比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者一般臨床情況

收集第四軍醫大學西京醫院婦產科收治術前未接受任何治療的宮頸鱗癌初治患者80例，患者年齡33～56歲，平均46.28±9.51歲。臨床分期：早期55例，晚期25例；按細胞學分級分為：高分化27例，中分化38例，低分化15例。在80例宮頸癌患者中，發生淋巴結轉移34例，宮旁浸潤5例。

2.2 糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白在宮頸癌組織中的表達情況

宮頸癌組織中GSK3β為胞漿表達，陽性率為18.8%(15/80)，p-GSK3βser9主要為胞漿和胞核共表達，陽性率為12.5%(10/80)，p-GSK3βTyr216主要為胞漿表達，也可見胞漿胞核共表達，陽性率為68.8%(55/80)，見圖1。

注：A為宮頸癌組織中GSK3β呈胞漿表達；B為宮頸癌組織中p-GSK3βser9呈核漿共表達；C為宮頸癌組織中p-GSK3βTyr216呈核漿共表達。

圖1 宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216的表達(SP×100)

Fig.1 Expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma tissues (SP×100)

2.3 糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白表達與宮頸癌臨床病理因素的關系

對宮頸癌中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達情況與宮頸癌臨床病理因素的相關性進行分析，結果表明GSK3β和p-GSK3βTyr216在早期(Ⅰ+Ⅱ)宮頸癌患者中表達均顯著高于中晚期(Ⅲ+Ⅳ)宮頸癌患者(25.5% vs. 4.0%，χ2=5.193，P=0.029；76.4% vs. 52.0%，χ2=4.749，P=0.039)，p-GSK3βser9在早期(Ⅰ+Ⅱ)宮頸癌患者中表達顯著低于中晚期(Ⅲ+Ⅳ)宮頸癌患者(5.5% vs. 28.0%，χ2=7.988，P=0.009)。p-GSK3βser9在高分化、中分化、低分化宮頸癌組織中表達陽性率分別為7.4%，7.9%和33.3%，隨著細胞學分級降低，p-GSK3βser9陽性率也隨之升高(χ2=7.329，P=0.031)，而GSK3β和p-GSK3βTyr216陽性率在不同細胞學分級宮頸癌患者中差異無統計學意義(均P>0.05)。GSK3β和p-GSK3βTyr216在淋巴結轉移陽性的宮頸癌患者中表達均顯著低于淋巴結轉移陰性的宮頸癌患者5.9% vs. 28.3%，χ2=6.427，P=0.018；52.9% vs. 80.4%，χ2=6.878，P=0.014)，p-GSK3βser9在淋巴結轉移陽性的宮頸癌患者中表達顯著高于淋巴結轉移陰性的宮頸癌患者(23.5% vs. 4.3%，χ2=6.577，P=0.015)。此外GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達在發生宮旁浸潤的宮頸癌患者和未發生宮旁浸潤的宮頸癌患者之間差異無統計學意義(均P>0.05)。

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，我國是宮頸癌高發地區，據報道，目前我國宮頸癌發病率以平均每年14.4%～22.5%的速度遞增，宮頸癌的防治形勢日益嚴峻[1]。通過對宮頸癌發生發展中的關鍵基因及信號通路的探索研究將有助于宮頸癌癌前病變的早期發現和治療，具有重要的臨床意義。

3.1 糖原合成酶激酶3β在腫瘤組織中作用具有組織特異性

GSK3β屬于絲氨酸/蘇氨酸類激酶，生物學功能復雜，在腫瘤細胞的細胞分化、細胞周期、細胞凋亡、侵襲/轉移、轉錄因子調控等方面發揮重要作用[3-5]。GSK3β在腫瘤發生發展中的作用具有較大爭議，主要原因為GSK3β具有組織特異性。現已證實前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中GSK3β表達增高[6-7]，過表達激活型GSK3β可促進cyclinD1等細胞周期相關基因表達增加，促進腫瘤細胞增殖和存活；而抑制GSK3β活性可顯著抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞死亡[8-9]。但是也有一些研究表明，在口腔癌、食管癌、鼻咽癌等腫瘤組織中出現GSK3β失活即p-GSK3βser9表達增加，提示GSK3β對于某些腫瘤具有抑癌作用[10-11]。由于GSK3β對于不同的腫瘤具有組織特異性，因此探索不同類型腫瘤組織中GSK3β及其磷酸化水平對于深入理解GSK3β在腫瘤發生發展中的作用機制具有重大意義。目前宮頸癌組織中GSK3β及其磷酸化水平的研究尚未見報道。

3.2 宮頸癌組織中糖原合成酶激酶3β及其磷酸化蛋白表達與臨床分期、細胞學分級和淋巴結轉移相關

本研究用免疫組化對80例宮頸癌組織中GSK3β、p-GSK3βser9和p-GSK3βTyr216表達進行了檢測，結果顯示宮頸癌組織中GSK3β陽性率僅為18.8%。對GSK3β、p-GSK3βser9(GSK3β失活)和p-GSK3βTyr216(GSK3β激活)表達與宮頸癌臨床病理因素的關系進行統計分析，結果表明GSK3β和p-GSK3βTyr216陽性率在早期宮頸癌組織中顯著高于晚期宮頸癌組織，而p-GSK3βser9陽性率在早期宮頸癌組織中顯著低于晚期宮頸癌組織(均P<0.05)。此外，GSK3β和p-GSK3βTyr216在宮頸癌淋巴結轉移陽性的腫瘤組織中表達陽性率顯著低于淋巴結轉移陰性的腫瘤組織，而p-GSK3βser9在宮頸癌淋巴結轉移陽性的腫瘤組織中表達陽性率顯著高于淋巴結轉移陰性的腫瘤組織(均P<0.05)。上述結果表明，在宮頸癌發展過程中GSK3β蛋白表達及活性逐漸降低，提示GSK3β可能在宮頸癌組織中為抑癌基因。值得注意的是，隨著細胞學分級降低，p-GSK3βser9陽性率也隨之升高，而GSK3β和p-GSK3βTyr216陽性率在不同細胞學分級宮頸癌患者中差異無統計學意義(均P>0.05)。這一結果提示GSK3β活性降低促進了宮頸癌的惡性轉化。有研究表明，GSK3β磷酸化失活可激活Wnt信號通路，通過維持β-catenin的穩定促進腫瘤細胞的惡性轉化[12-13]。

綜上所述，在宮頸癌發展過程中GSK3β蛋白表達及活性逐漸降低，提示GSK3β基因可能在宮頸癌組織中為抑癌基因，但GSK3β基因及其磷酸化水平在宮頸癌發生發展中的具體機制還有待進一步深入研究探討。

[1]胡尚英,鄭榮壽,趙方輝,等.1989至2008年中國女性子宮頸癌發病和死亡趨勢分析[J].中國醫學科學院學報,2014,36(2):119-125.

[2]Rattanalappaiboon D, Kietpeerakool C, Kleebkaow P,etal.Factors affecting compliance in the first year of postcolposcopy surveillance among women with a high incidence of cervical cancer[J].International Journal of Gynaecology and Obstetrics:the Official Organ of the International Federation of Gynaecology and Obstetrics,2014,124(2):160-163.

[3]Luo J.Glycogen synthase kinase 3beta(GSK3beta) in tumorigenesis and cancer chemotherapy[J].Cancer Letters,2009,273(2):194-200.

[4]Shimura T.Acquired radioresistance of cancer and the AKT/GSK3beta/cyclin D1 overexpression cycle[J].Journal of Radiation Research,2011,52(5):539-544.

[5]Zeng J, LiuD, Qiu Z,etal.GSK3beta overexpression indicates poor prognosis and its inhibition reduces cell proliferation and survival of non-small cell lung cancer cells[J].PLoS One,2014,9(3):e91231.

[6]Li R, Erdamar S, Dai H,etal.Cytoplasmic accumulation of glycogen synthase kinase-3beta is associated with aggressive clinicopathological features in human prostate cancer[J].Anticancer Research,2009,29(6):2077-2081.

[7]Naito S, Bilim V, Yuuki K,etal.Glycogen synthase kinase-3beta:a prognostic marker and a potential therapeutic target in human bladder cancer[J].Clinical Cancer Research,2010,16(21):5124-5132.

[8]Schutz S V, Cronauer M V, Rinnab L.Inhibition of glycogen synthase kinase-3beta promotes nuclear export of the androgen receptor through a CRM1-dependent mechanism in prostate cancer cell lines[J].Journal of Cellular Biochemistry,2010,109(6):1192-1200.

[9]Schutz S V, Schrader A J, Zengerling F,etal.Inhibition of glycogen synthase kinase-3beta counteracts ligand-independent activity of the androgen receptor in castration resistant prostate cancer[J].PLoS One,2011,6(9):e25341.

[10]Suzuki M, Shinohara F, Endo M,etal.Zebularine suppresses the apoptotic potential of 5-fluorouracil via cAMP/PKA/CREB pathway against human oral squamous cell carcinoma cells[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2009,64(2):223-232.

[11]Paccez J D, Duncan K, Vava A,etal.Inactivation of GSK3beta and activation of NF-kappaB pathway via Axl represents an important mediator of tumorigenesis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Molecular Biology of the Cell,2015,26(5):821-831.

[12]Rath G, Jawanjal P, Salhan S,etal.Clinical significance of inactivated glycogen synthase kinase 3β in HPV-associated cervical cancer: Relationship with Wnt/β-catenin pathway activation[J].American Journal of Reproductive Immunology,2015,73(5):460-478.

[13]Wang S, Bao Z, Liang Q M,etal. Octreotide stimulates somatostatin receptor-induced apoptosis of SW480 colon cancer cells by activation of glycogen synthase kinase-3β, A Wnt/β-catenin pathway modulator [J].Hepato-gastroenterology,2013,60(127):1639-1646.

[專業責任編輯：張忠明]

Expression and clinical significance of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma

CHEN Liang-feng1,2, ZHANG Ying1,3, WANG Zhong-qi2, DI Man1, ZHENG Fu-li4, WANG Jian1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,AnkangCityCentralHospital,ShaanxiAnkang725000,China;3.DepartmentofGynecologyandObstetrics,PLA323Hospital,ShaanxiXi’an710054,China;4.DepartmentofGynecologyandObstetrics,SecondAffiliatedHospital,ShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,ShaanxiXianyang712000,China)

Objective To investigate the expressions of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma and their correlation with clinical pathological factors. Methods By using immunohistochemistry, GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216protein expressions were detected in 80 cases of cervical carcinoma admitted in Xijing Hospital of Fourth Military Medical University during January 2012 to December 2014. The correlations between expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216and clinicopathological factors were analyzed. Results The positive expression rates of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma were 18.8%, 68.8% and 12.5%, respectively. The expressions of GSK3β and p-GSK3βTyr216in early stage group were significantly higher than those in advanced stage group (25.5% vs 4.0%,χ2=5.193,P=0.029; 76.4% vs 52.0%,χ2=4.749,P=0.039), but the expression rate of p-GSK3βser9was obviously lower (5.5% vs 28.0%,χ2=7.988,P=0.009). The positive expression rates of p-GSK3βser9in well and moderately differentiated tumors were lower than those in poorly differentiated tumors (7.4%, 7.9% and 33.3%,χ2=7.329,P=0.031). The expressions of GSK3β and p-GSK3βTyr216were significantly lower in patients with positive lymph node metastasis than in those with negative lymph node status (5.9% vs 28.3%,χ2=6.427,P=0.018; 52.9% vs 80.4%,χ2=6.878,P=0.014), but the expression of p-GSK3βser9was higher in patients with lymph node metastases (23.5% vs 4.3%,χ2=6.577,P=0.015). Conclusion The expressions of GSK3β, p-GSK3βser9and p-GSK3βTyr216in cervical carcinoma are correlated with clinical TNM staging, histological grades and lymph node metastases, which suggests that GSK3β may play a potential role in cervical tumor genesis.

cervix; carcinoma; glycogen synthase kinase 3β(GSK3β); immunohistochemistry

2015-06-17

國家自然科學基金資助項目(編號：81172458)；國家自然科學基金青年基金資助項目(編號：81302243)

陳良鳳(1981-)，女，陜西省安康市中心醫院婦產科主治醫生，現為第四軍醫大學西京醫院婦產科在讀研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

王 建，教授，第四軍醫大學西京醫院婦產科主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.009

R737.33

A

1673-5293(2015)05-0934-04