機械刺激對小鼠子宮內膜組織形態及ICAM-1的影響

羅國群，馬文敏，陳孟循，葉泉英，趙 軍，朱 莉

(1.佛山市婦幼保健院生殖醫學中心，廣東 佛山 528000；2.佛山市科技學院藥理教研室，廣東 佛山 528000)

機械刺激對小鼠子宮內膜組織形態及ICAM-1的影響

羅國群1，馬文敏1，陳孟循1，葉泉英2，趙 軍1，朱 莉1

(1.佛山市婦幼保健院生殖醫學中心，廣東 佛山 528000；2.佛山市科技學院藥理教研室，廣東 佛山 528000)

目的 探討機械刺激對子宮內膜容受性影響的機理。方法 將96只雌性小白鼠隨機分成對照組和刺激組。對照組在小鼠動情前期不刺激子宮內膜，在動情期刮取子宮內膜。刺激組在小鼠動情前期先接受特制小號刮匙刺激子宮內膜1次，在動情期刮取子宮內膜。對兩組的子宮內膜進行圖像分析，并采用免疫組織化學法檢測細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達。結果 子宮內膜ICAM-1免疫組化陽性著色主要分布于子宮內膜腔上皮、腺上皮和基質細胞的胞漿中。刺激組子宮內膜腺/間比值較對照組高，差異有極顯著性意義(t=18.36，P<0.01)。刺激組ICAM-1表達較對照組的ICAM-1表達強，差異有極顯著意義(t=11.63，P<0.01)。結論 推測機械刺激提高子宮內膜的容受性與促使子宮內膜腺體發育、增加子宮內膜容受性標志物的表達有關。

機械刺激；子宮內膜；容受性；細胞間黏附分子-1

胚胎著床是從胚泡植入子宮內膜開始的一系列細胞、分子信號傳遞過程，成功的著床不僅取決于胚胎的質量，而且取決于子宮內膜的容受性。子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎的接受能力，即允許胚胎黏附其上直至植入完成的特定階段，它受嚴格的時空限制。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)著床失敗的病例中約有2/3是由于子宮內膜容受性不良導致的，因此，提高子宮內膜容受性對提高胚胎著床率及臨床妊娠率非常重要。

對子宮內膜回聲紊亂或子宮內膜異常增厚的患者，采用機械刺激子宮內膜可以提高患者胚胎著床率、臨床妊娠率和活產率，但對其機理尚缺少理論研究。本研究將用動物模型，比較未接受機械刺激和機械刺激子宮內膜的組織形態結構，從組織形態結構探討機械刺激對子宮內膜的影響，尋找調節子宮內膜胚胎著床的分子生物學基礎，為人工調控子宮內膜接受性提供可靠的理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組

2013年2至6月選取清潔級、體重為20～25g的雌性8周齡昆明小白鼠(購于中山大學實驗動物中心)。雌性小白鼠動情周期為4～5d，分為4期：動情前期、動情期、動情后期和動情間期。每日上午9:00時取小白鼠陰道分泌物涂片行HE染色檢查，確定其動情周期，連續2個動情周期均正常，將小白鼠編號，用Excel分析工具中隨機數字發生器產生隨機數字，對應隨機數字將小白鼠分成對照組和刺激組，每組48只。

1.2 機械刺激子宮內膜方法及標本的采集

對照組在小鼠動情前期將刮匙放進子宮但不刺激內膜，在動情期刮取子宮內膜；刺激組在小鼠動情前期用特制小號刮匙刺激子宮內膜，動情期刮取子宮內膜。將兩組所刮取的新鮮子宮內膜用生理鹽水反復沖凈后放入4%多聚甲醛中固定，制成石蠟切片(4μm)，所有子宮內膜標本常規固定、脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色，用作圖像分析及免疫組化檢測細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)。

1.3 標本制備與分析

1.3.1 圖像分析

將子宮內膜切片置于OLYM-PUS顯微鏡下，用MIAS多功能圖像分析儀在高倍鏡下(×100)采集圖像，每張切片選擇10個視野進行測量，選取其中具代表性的5幀，每例標本的結果為5幀畫面的平均值。

視野選擇及檢測標準：每個待測視野腺體數不少于3個。為了避免所測腺體因測量切面不同產生誤差，統一對腺體的橫切面進行測量(腺體縱橫徑之比不超過3∶1)。待測視野經攝像系統掃描后顯示于電腦熒光屏上，用鼠標分別勾畫被測腺體基底面(外側輪廓)和腺腔面(內腔輪廓)，計算機分析系統測量并計算每個視野腺體面積/間質面積比(簡稱腺/間比值，反映腺體密度)。

計算公式：每個視野腺體(腺上皮細胞)面積(%)=每個視野腺體面積之和/每個視野固定面積×100%。每個視野間質面積(%)=(每個視野固定面積-每視野腺體總面積)/每個視野固定面積×100%。

1.3.2 免疫組化檢測

采用免疫組化SP法，標本經固定、包埋、制成蠟塊、切片、脫蠟至水、高壓修復的標準免疫組織化學操作程序，DAB顯色，采用鼠ICAM-1 IgG單克隆抗體和免疫組織化學試劑盒(均購自北京中山試劑公司)，每批免疫組化均設有用PBS代替一抗的陰性對照。ICAM-1均以細胞漿內出現明確的棕黃色顆粒為陽性細胞。

根據Watanabe等的免疫組織化學半定量評分標準，每張切片任意選5個視野，觀察其陽性細胞胞漿表達強度，無表達為陰性(-)記0分、陽性顆粒呈淺黃色為可疑陽性(±)記1分、淺棕色為弱陽性(+)記2分、棕黃色為陽性(++)記3分、棕褐色為強陽性(+++)記4分。

計算陽性細胞百分數(5個視野的平均數)，無表達為陰性記0分、1%～15%為可疑陽性記1分、16%～50%為弱陽性記2分、51%～85%為陽性記3分、86%～100%為強陽性記4分。

標本的陽性指數=(陽性細胞表達強度×陽性細胞百分數)/2。每份標本都由固定的2人同時觀察完成。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 組織形態特征

對照組的子宮內膜表現為腺腔輕度擴大、彎曲較小，腺上皮細胞整齊地排列成一圈，高柱狀，核卵圓形，位于細胞中部，見核下空泡；間質水腫不明顯，見圖1。

刺激組的子宮內膜表現為子宮內膜腺體彎曲、腺腔大，腺體間靠近，腺腔內有分泌物，腺上皮細胞柱狀單層排列，核圓形，位于細胞基底部，核質均勻略深，頂漿分泌旺盛；間質輕度水腫，細胞呈卵圓形或星形，核卵圓形，見圖2。

刺激組子宮內膜腺/間比值較對照組高，差異有顯著統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖2 刺激組的子宮內膜組織形態(HE×100)

Fig.2 Endometrial histomorphology of the stimulation group(HE×100)

2.2 分子生物學標志

小白鼠子宮內膜ICAM-1免疫組化陽性著色主要分布于子宮內膜腔上皮、腺上皮和基質細胞的胞漿中，對照組ICAM-1蛋白呈陽性(++)表達，刺激組ICAM-1蛋白呈強陽性(+++)表達，見圖3、圖4。

刺激組ICAM-1蛋白表達較對照組的ICAM-1蛋白表達強，差異有顯著統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖3 對照組ICAM-1蛋白的陽性(++)表達(SP×200)Fig.3 Positive expression of ICAM-1 protein in the control group(SP×200)

圖4 刺激組ICAM-1蛋白的強陽性(+++)表達(SP×200)

Fig.4 Strong-positive expression of ICAM-1 protein in the stimulation group(SP×200)

3 討論

3.1 提高子宮內膜容受性的意義

正常子宮內膜僅在一個極短的關鍵時期內允許胚胎著床，這一時期代表著子宮內膜對胚胎的接受性達到最高，稱為“著床窗”(nidation window)，或稱“種植窗”(implantation window，IW)，又稱為“著床窗期”(peri-implantation period)。人類的此期通常在正常月經周期排卵后的6～8d，或受精后5～7d，持續不超過48h；在大鼠、小鼠等嚙齒類動物中，種植窗在受精后4d，持續約24h。胚胎只有在這一時期才能植入，在種植窗開放前或后，胚胎都不能植入。

IVF-ET失敗的原因有1/3歸因于胚胎質量欠佳，另外2/3歸因于子宮內膜容受性差。內膜不成熟或不處于著床窗口期，即使移植優質的胚胎，也會導致很低的著床率。胚胎著床的成功與否在很大程度上還取決于胚胎與可容受性子宮內膜間的相互作用，即雙方建立“對話”機制，胚胎才可以在子宮內膜中正常著床[1]。

子宮內膜的超聲形態分為3種類型：A型為三線型或多層子宮內膜，為外層和中部強回聲以及內層低回聲或暗區，宮腔中線回聲明顯；B型為弱三線型，宮腔中線回聲不明顯；C型為均質強回聲，無宮腔中線回聲。人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射日子宮內膜回聲類型和胚胎著床率相關，子宮內膜回聲紊亂或子宮內膜異常增厚可能會影響子宮內膜容受性，阻止胚胎著床。

因此，提高子宮內膜容受性對提高胚胎著床率及臨床妊娠率非常重要。

3.2 機械刺激子宮內膜對子宮內膜容受性的影響

目前已經有很對研究證實可以通過對子宮內膜進行搔刮，提高子宮內膜的著床率。Narvekar等[2]選擇了100例前次移植優質胚胎而失敗的患者，分為子宮內膜機械刺激組及對照組，發現機械刺激組其胚胎著床率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于對照組(13.07% vs. 7.1%；32.7% vs. 13.7%；22.4% vs. 9.8%)。Potdar等[3]將7個對照研究(4個隨機試驗，3個非隨機試驗)進行了Meta分析，結果顯示，在反復種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)患者促排卵周期中行子宮內膜機械刺激，臨床妊娠率在70%左右，說明機械刺激子宮內膜可以提高RIF患者的臨床妊娠率。羅國群等[4]選取行IVF-ET且其自然月經周期卵泡晚期超聲提示子宮內膜形態不良的不育患者63例，隨機分為研究組和對照組。研究組在胚胎移植前1～2周對子宮內膜行機械刺激，對照組未行機械刺激，發現研究組子宮內膜形態及子宮內膜和內膜下血流均較對照組有明顯改善(均P<0.01)；研究組的胚胎種植率及臨床妊娠率明顯高于對照組(P<0.01)，早期流產率明顯降低(P<0.01)。

可見，機械刺激子宮內膜有助于改善IVF-ET的妊娠結局，其作為提高胚胎著床率的有效途徑，對于IVF助孕后的妊娠極具價值。

3.3 機械刺激子宮內膜提高子宮內膜容受性的作用機制

機械刺激子宮內膜能夠提高子宮內膜容受性，但其作用機制不甚明確。

Loeb等在1907年觀察到，局部損傷幾內亞豬的子宮內膜，能夠促其快速蛻膜化，其蛻膜細胞的發育完全等同于正常蛻膜細胞的發育。Dekel等[5]研究認為，機械刺激子宮內膜是通過提高免疫應答而增加子宮內膜的容受性。Gnainsky等[6]認為機械刺激子宮內膜后，在局部會產生炎癥反應，使巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)含量增加，兩者在子宮內膜的蛻膜化和著床方面起非常重要的作用。羅國群等[4]，機械刺激子宮內膜可以促進上皮細胞和基質細胞的增生和分化，以及調節毛細血管的舒縮活動，提高子宮內膜的血流量，增加基質的水腫和蛻膜化，從而促進胚胎著床。Almog等[7]認為，機械刺激子宮內膜可以通過調節對著床起重要作用的相關因子如層粘連蛋白a4、整合素a6的表達來提高子宮內膜的容受性。Kalma等[8]認為，機械刺激通過增加生長因子的分泌使子宮內膜容受性提高。

子宮內膜種植窗出現的一些形態學和分泌蛋白等的變化，表現為胞飲突出現，黏附分子、細胞因子、生長因子以及免疫分子上調或下調，這些變化可作為種植窗開放的標志[9]。ICAM-1是一種跨膜糖蛋白，持續表達于所有類型細胞的表面。ICAM-1目前被認為是種植窗預測的金標準。它在子宮內膜上皮細胞表面、腺體表層細胞表面或是細胞外基質中呈現時間、空間的特異性表達，并被認為在胚胎的著床過程中起重要作用。

本研究應用圖像分析技術對小鼠子宮內膜組織形態特征進行檢查，結果發現刺激組的子宮內膜分泌反應較對照組有明顯改善，刺激組子宮內膜腺/間比值較對照組高，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。本研究應用免疫組化檢測小鼠子宮內膜ICAM-1的表達，發現ICAM-1免疫組化陽性著色主要分布于子宮內膜腔上皮、腺上皮和基質細胞的胞漿中。刺激組的ICAM-1表達較對照組的ICAM-1表達強，差異有統計學意義(P<0.05)。

本研究結果認為機械刺激可使子宮內膜腺體/間質比值增加，增強子宮內膜容受性標志物如ICAM-1的表達，推測機械刺激提高子宮內膜的容受性與促使子宮內膜腺體發育、增加子宮內膜容受性標志物的表達有關。

[1]Heger A,Sator M,Pietrowski D.Endometrial Receptivity and its Predictive Value for IVF/ICSI-Outcome[J].Geburtshilfe Frauenheilkd,2012,72(8):710-715.

[2]Narvekar S A, Gupta N, Shetty N,etal.Does local endometrial injury in the nontransfer cycle improve the IVF-ET outcome in the subsequent cycle in patients with previous unsuccessful IVF? A randomized controlled pilot study[J].J Hum Reprod Sci,2010,3(1):15-19.

[3]Potdar N, Gelbaya T, Nardo L G.Endometrial injury to overcome recurrent embryo implantation failure:a systematic review and meta-analysis[J].Reprod Bio Med Online,2012,25(6):561-571.

[4]羅國群,鄧偉芬,馬文敏.機械刺激子宮內膜對內膜形態不良者IVF-ET臨床結局的影響[J].生殖與避孕,2012,32(2):139-143.

[5]Dekel N, Gnainsky Y, Granot I,etal.Inflammation and implantation[J].Am J Reprod Immunol,2010,63(1):17-21.

[6]Gnainsky Y, Granot I, Aldo P B,etal.Local injury of the endometriuminduces an inflammatory response that promotes successful implantation[J].Fertil Steril,2010,94(6):2030-2036.

[7]Almog B, Shalom-Paz E, Dufort D,etal.Promoting implantation by local injury to the endometrium[J].Fertil Steril,2010,94(6):2026-2029.

[8]Kalma Y, Granot I, Gnainsky Y,etal.Endometrial biopsyinduced gene modulation:first evidence for the expression bladder-transmembranal uroplakin Ib in human endometrium[J].Fertil Steril,2009,91(4):1042-1049.

[9]呂忠梅,蔡霞.子宮內膜容受性相關標志物的研究進展[J].中國婦幼健康研究,2013,24(6):958-960.

[專業責任編輯：張忠明]

Effect of mechanical stimulation on mice endometrial histomorphology and ICAM-1 expression

LUO Guo-qun1, MA Wen-min1, CHEN Meng-xun1, YE Quan-ying2, ZHAO Jun1, ZHU Li1

(1.ReproductiveMedicineCenterofFoshanMaternalandChildren’sHospital,GuangdongFoshan528000,China;2.PharmacologyTeachingandResearchSection,FoshanUniversity,GuangdongFoshan528000,China)

Objective To study the effect of mechanical stimulation on endometrial receptivity. Methods A total of 96 female mice were randomly divided into control group and stimulation group. In stimulation group, emdometrium was scraped both in proestrus and estrus, compared with that only in estrus in control group. Endometrial images of two groups were analyzed and the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) protein in endometrium was determined by immunohistochemistry. Results The expression of ICAM-1 was mainly distributed in the cytoplasm of the luminal epithelium, glandular and stroma cells. The ratio of gland/stroma in the stimulation group was significantly higher compared with the control group, and the difference was significant (t=18.36,P<0.01). The expression of ICAM-1 in the stimulation group was significantly higher than that in the control group with significant difference (t=11.63,P<0.01).Conclusion Mechanical stimulating improves the endometrial receptivity by improving the development of endometrial gland and increasing the expression of ICAM-1.

mechanical stimulation；endometrium；receptivity；intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)

2015-02-01

本課題為佛山市科技局立項資助項目(項目編號:201208008)

羅國群(1968-)，女，主任醫師，碩士，主要從事生殖醫學的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.011

R711.5;R361.3

A

1673-5293(2015)05-0941-03