宮頸癌新輔助化療前后PHD3、HIF-1和NF-κB的表達(dá)及意義

楊海濤，林 毅，鐘惠珍

(1.寧波市病理診斷中心，浙江 寧波 315000；2.寧波市婦女兒童醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

宮頸癌新輔助化療前后PHD3、HIF-1和NF-κB的表達(dá)及意義

楊海濤1，林 毅2，鐘惠珍2

(1.寧波市病理診斷中心，浙江 寧波 315000；2.寧波市婦女兒童醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

目的 探討脯氨酸羥基化酶3(PHD3)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)在宮頸癌新輔助化療前后癌組織中的表達(dá)分布，及其在預(yù)測(cè)腫瘤耐藥性和預(yù)后中的臨床意義。方法 選取確診為宮頸癌患者60例，術(shù)前均行2個(gè)療程紫杉醇加順鉑(TP)方案化療。應(yīng)用SP免疫組織化學(xué)法檢測(cè)60例患者化療前后癌組織中PHD3、HIF-1和NF-κB的蛋白水平，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 PHD3、NF-κB蛋白在宮頸癌組織及正常宮頸組織中均有表達(dá)分布；HIF-1在正常宮頸組織中基本無(wú)表達(dá)，而在宮頸癌組織中明顯表達(dá)。在正常宮頸組織中，PHD3和NF-κB蛋白表達(dá)分布顯著低于在癌組織中(χ2值分別為5.372，4.521，均P<0.05)。PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌不同病理分級(jí)、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.193、4.463、11.854，均P<0.05)。化療后宮頸癌組織中HIF-1和NF-κB表達(dá)較化療前均有所降低，而PHD3的表達(dá)較化療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.112、7.532，均P<0.05)。PHD3、HIF-1和NF-κB表達(dá)陽(yáng)性者與陰性者化療有效率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為11.726、7.205，均P<0.05)。結(jié)論 PHD3、HIF-1和NF-κB可以作為判定宮頸癌侵襲能力及預(yù)判化療有效的指標(biāo)之一，對(duì)宮頸癌的預(yù)后判斷具有重要意義。

宮頸癌；脯氨酸羥基化酶3；缺氧誘導(dǎo)因子-1；核轉(zhuǎn)錄因子κB

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期以手術(shù)治療為主，中晚期大多采用同步放化療。近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。隨著一些新型化療藥物的研制成功及臨床研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)許多宮頸癌患者具有良好療效，宮頸癌的化療越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的重視。

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NACT)是指在手術(shù)或放療前所進(jìn)行的輔助性化療，由于其具有縮小腫瘤體積、降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、減少微轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后因素等作用，目前已成為宮頸癌綜合治療中的一大亮點(diǎn)。尤其對(duì)局部晚期宮頸癌，NACT聯(lián)合手術(shù)，不僅可改善預(yù)后，還可保留卵巢和陰道功能。然而，由于腫瘤本身及個(gè)體間異質(zhì)性的存在，不同個(gè)體間化療療效仍存在很大差異，有文獻(xiàn)報(bào)道約15%～35%的宮頸癌患者對(duì)NACT不敏感且通過(guò)改變化療方案并不能顯著改善這種狀況[1]。臨床實(shí)踐表明，患者的預(yù)后及生存率取決于腫瘤對(duì)NACT藥物的反應(yīng)性，對(duì)藥物不敏感者采用化療不僅會(huì)貽誤治療時(shí)機(jī)，而且還可能誘導(dǎo)對(duì)放療不敏感，影響預(yù)后。為使更多的患者能從NACT中受益，探索可預(yù)測(cè)宮頸癌化療敏感性生物學(xué)指標(biāo)成為該領(lǐng)域近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

本研究通過(guò)采用免疫組化法檢測(cè)宮頸癌患者行NACT前后癌組織及癌旁正常組織中脯氨酸羥基化酶3(PHD3)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的表達(dá)，探討其在預(yù)測(cè)腫瘤的耐藥性及預(yù)后的臨床意義。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

全部標(biāo)本均來(lái)自2011年1月至2013年8月在寧波市婦女兒童醫(yī)院婦科就診確診為宮頸癌的患者60例，年齡32～68歲，中位年齡46歲；原發(fā)腫瘤直徑大于4cm，臨床分期為Ⅰb2～Ⅱa期，無(wú)化療禁忌，術(shù)前均行2個(gè)療程紫杉醇加順鉑(TP)方案化療：紫杉醇175mg/m2滴注3小時(shí)，隨后滴注順鉑(DDP)75mg/m2，療程間隔3周。化療后3周行手術(shù)治療，取化療前及手術(shù)后腫瘤組織待檢測(cè)，觀測(cè)化療前后腫塊大小，以及距離癌組織2cm以外的癌旁正常宮頸組織為正常宮頸對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4μm厚的石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟，采用免疫組化染色SP法測(cè)定PHD3、HIF-1和NF-κB的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照：3%過(guò)氧化氫37℃孵育10分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗滌；微波修復(fù)抗原，PBS洗滌；10%山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘，用1:100稀釋的PHD3、HIF-1和NF-κB多克隆抗體4℃過(guò)夜孵育，PBS洗滌，加生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體室溫孵育30分鐘，PBS沖洗，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育30分鐘，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素復(fù)染，封片，鏡下觀察。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 化療療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

參照世界衛(wèi)生組織制定的療效判定標(biāo)準(zhǔn)，肉眼觀察評(píng)估腫瘤大小，化療后與化療前相比腫瘤最大直徑縮小≥30%或兩垂直徑線乘積縮小≥50%者為有效，否則為無(wú)效。

1.3.2 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)

PHD3、HIF-1和NF-κB陽(yáng)性染色的判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)出棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞占同類細(xì)胞的百分比小于10%即為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較各組間蛋白表達(dá)差異，相關(guān)性比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)在宮頸癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)分布

免疫組化結(jié)果顯示PHD3、NF-κB蛋白在宮頸癌組織及正常宮頸組織中均有表達(dá)分布，HIF-1在正常宮頸組織中基本上無(wú)表達(dá)，在宮頸癌組織中明顯表達(dá)。正常宮頸組織中PHD3和NF-κB蛋白的表達(dá)分布均顯著低于癌組織(χ2值分別為5.372，4.521，均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同宮頸組織中PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白的表達(dá)分布比較[n(%)]

Table 1 Comparison of expression distribution of PHD3,HIF-1 and NF-κB in different tissues of cervix [n(%)]

2.2 各指標(biāo)表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)分布與宮頸癌不同臨床分期、病理分級(jí)及淋巴轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而與患者年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 PHD3、HIF-1和NF-κB蛋白表達(dá)分布與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系比較[n(%)]

Table 2 Relationship between the expression distribution of PHD3, HIF-1 and NF-κB and the clinical pathological characteristics of cervical cancer[n(%)]

2.3 各指標(biāo)在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

在60例宮頸癌組織中，PHD3與HIF-1及NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(r值分別為0.573、0.629，均P<0.05)，HIF-1的表達(dá)與NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.697，P<0.05)，見(jiàn)表3、表4。

2.4 新輔助化療對(duì)宮頸癌的臨床療效

對(duì)60例患者NACT后均行婦科檢查，發(fā)現(xiàn)癌組織縮小1/3～1/2，其中無(wú)效9例，有效51例，總有效率為85.00%。

表3 PHD3與HIF-1及NF-κB在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性比較(n)

Table 3 Comparison of the relationship between PHD3 and HIF-1 and that between PHD3 and NF-κB in cervical cancer(n)

2.5 新輔助化療對(duì)宮頸癌組織中各指標(biāo)表達(dá)的影響

對(duì)60例患者行NACT后，HIF-1和NF-κB表達(dá)比例均有所降低，PHD3的表達(dá)比例有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表5。

表4 HIF-1與NF-κB在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性比較(n)

Table 4 Comparison of the relationship between expression of HIF-1 and NF-κB in cervical cancer(n)

2.6 新輔助化療后各指標(biāo)療效情況

在60例宮頸癌組織中，PHD3、HIF-1和NF-κB表達(dá)陽(yáng)性率與陰性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 宮頸癌組織中PHD3、HIF-1和NF-κB表達(dá)與新輔助化療療效關(guān)系[n(%)]

Table 6 Relationship of the expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB in cervical cancer tissues with the effect of neoadjuvant chemotherapy[n(%)]

3 討論

3.1 新輔助化療治療宮頸癌的現(xiàn)狀

大量研究表明，NACT顯著提高了手術(shù)切除率，降低了宮旁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓等發(fā)生的比例，患者5年生存率明顯提高[2]。然而，還有部分患者對(duì)NACT不敏感，Marchiole等[3]研究顯示，部分腫瘤大于2cm的宮頸癌患者NACT后腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)仍大于3mm，這些患者被認(rèn)為對(duì)NACT不敏感，且術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。如果對(duì)這部分患者仍進(jìn)行NACT治療就會(huì)延誤治療時(shí)機(jī)，造成不必要的痛苦和浪費(fèi)。

3.2 宮頸癌化療敏感性及耐藥的研究

以往對(duì)影響宮頸癌化療敏感性多集中在一些臨床病理參數(shù)及腫瘤細(xì)胞本身異質(zhì)性的研究，如：組織學(xué)類型、腫瘤大小、治療前血鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)和血紅蛋白(Hb)水平、腫瘤細(xì)胞中各種因子(多藥耐藥基因、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖和調(diào)亡因子、與DNA損傷修復(fù)相關(guān)因子)的表達(dá)差異等；但迄今為止這些指標(biāo)對(duì)于臨床的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值仍十分有限，尚不能較理想地預(yù)測(cè)腫瘤的耐藥性及預(yù)后，這說(shuō)明還有許多未知的耐藥分子及機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

近來(lái)研究表明，除了腫瘤細(xì)胞本身的異質(zhì)性外，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也對(duì)腫瘤細(xì)胞治療的反應(yīng)性起重要作用。低氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的抵抗。Kato等(2006年)研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子—HIF-1表達(dá)增高，進(jìn)而通過(guò)上調(diào)其靶基因多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1，mdr 1)編碼的膜蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein，P-Gp)及凋亡相關(guān)Bcl-2家族成員(Bcl-XL和Bax)的表達(dá)而引起耐藥。PHD3是PHD家族的一員，PHD3可羥基化HIF-1分子中特定的脯氨酸，從而引起HIF-1的降解，并阻斷因HIF-1集聚和活化而引起的與腫瘤新生血管形成、腫瘤周圍組織侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)的下游基因的表達(dá)[4]。Place等[5]報(bào)道，PHD3在腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化當(dāng)中明顯下降，提示PHD3在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到保護(hù)性作用。Su等[6]發(fā)現(xiàn)，PHD3在分化良好的腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)增高，它可以通過(guò)HIF-1依賴和非依賴的途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。Rantanen等[7-8]使用結(jié)合于PHD3的羧基端加強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染人宮頸腺癌Hela細(xì)胞，在保留其羧基化活性和充足供氧的情況下，PHD3能誘導(dǎo)蛋白水解酶聚集和導(dǎo)致caspase依賴的細(xì)胞凋亡，而PHD的抑制劑二甲基酸草基甘氨酸能抑制這一過(guò)程。

3.3 宮頸癌新輔助化療前后脯氨酸羥基化酶3、缺氧誘導(dǎo)因子-1和核轉(zhuǎn)錄因子κB的表達(dá)

本研究60例行TP方案NACT的宮頸鱗癌患者，對(duì)化療敏感者與不敏感者癌組織中PHD3的表達(dá)存在明顯差異，提示PHD3基因可能是一個(gè)與宮頸癌NACT敏感性密切相關(guān)的基因。由于PHD3羥基化HIF-1分子中特定的脯氨酸可引起HIF-1的降解，而HIF-1的表達(dá)升高與多藥耐藥相關(guān)；另一方面，PHD3可抑制NF-κB信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路激活已證實(shí)在腫瘤耐藥中起重要作用。因此推測(cè)PHD3可能通過(guò)促進(jìn)HIF-1降解及抑制NF-κB信號(hào)通路而引起對(duì)藥物敏感性的改變。本研究結(jié)果也印證了上述推測(cè)，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)PHD3的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PHD3高表達(dá)的患者，淋巴轉(zhuǎn)移率低；顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，HIF-1的表達(dá)主要存在于壞死區(qū)和腫瘤侵襲的邊緣，這可能與腫瘤內(nèi)部氧水平降低有關(guān)。此外，本研究中，有效組化療后組織中HIF-1和NF-κB陽(yáng)性率明顯低于無(wú)效組，而PHD3的表達(dá)情況恰恰相反，換而言之，新輔助化療前組織中HIF-1和NF-κB的表達(dá)水平影響著患者化療療效，即新輔助化療前組織中HIF-1和NF-κB表達(dá)越高者，則患者對(duì)新輔助化療越不敏感，臨床療效越差。通過(guò)檢測(cè)新輔助化療前組織中的NF-κB與HIF-1表達(dá)水平，可以作為判斷宮頸癌新輔助化療敏感度的重要指標(biāo)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)NACT的有效率達(dá)85.00%，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的一致，提示NACT對(duì)于手術(shù)前宮頸癌患者有確切的臨床療效。腫瘤耐藥是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)抗癌藥物微環(huán)境的重要機(jī)制，實(shí)體腫瘤的低氧及多重耐藥是近年的研究熱點(diǎn)，但由于其機(jī)制的復(fù)雜性，目前尚無(wú)突破性結(jié)論。

目前，與PHD3、HIF-1和NF-κB相關(guān)的腫瘤治療方法多處于基礎(chǔ)研究階段，極少部分應(yīng)用于臨床，相信隨著對(duì)PHD3、HIF-1和NF-κB研究的不斷深入，對(duì)研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，判斷腫瘤的耐藥性、預(yù)后及治療將有深遠(yuǎn)的意義。本研究雖然從某些方面證實(shí)PHD3、HIF-1及NF-κB在宮頸癌NACT前后有顯著變化，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，對(duì)其在化療耐藥的作用也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。下一步擬完善對(duì)細(xì)胞耐藥性效應(yīng)的檢測(cè)，分別轉(zhuǎn)染psi-PHD3、pEGFP-PHD3的HeLa細(xì)胞株，未經(jīng)基因操作的HeLa細(xì)胞株，比較不同PHD3表達(dá)水平下，用藥后HIF-1與其相關(guān)底物分子mdr1、Bcl-XL和Bax的改變，進(jìn)一步證實(shí)PHD3可通過(guò)抑制NF-κB通路而影響宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性，并探討其機(jī)制。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張欣文]

Expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB before and after neoadjuvant chemotherapy in cervical cancer tissues and their significance

YANG Hai-tao1, LIN Yi2, ZHONG Hui-zhen2

(1.NingboPathologicalDiagnosisCenter,ZhejiangNingbo315000,China;2.NingboWomenandChildren’sHospital,ZhejiangNingbo315000,China)

Objective To investigate the expressions of prolyl hydroxylase 3 (PHD3), hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) and nuclear factor-κB (NF-κB) before and after neoadjuvant chemotherapy (NACT) in cervical cancer tissues, and to explore their clinical significance in prediction of drug resistance and prognosis.Methods Sixty patients with cervical cancer were selected, and they underwent two courses of paclitaxel plus cisplatin chemotherapy. PHD3, HIF-1 and NF-κB were detected by SP immunohistochemical method in 60 patients before and after chemotherapy. Results PHD3 and NF-κB protein expressed in both cervical carcinoma and normal cervical tissues. HIF-1 did not expressed in normal cervical tissues, but it obviously expressed in cervical carcinoma. The expressions of PHD3 and NF-κB protein in normal cervical tissues were significantly lower than those in cancer tissues (χ2value was 5.372 and 4.521, respectively, bothP<0.05). The positive expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB were closely related to the pathological grading, clinical staging and lymph node metastasis, and the differences were significant (χ2value was 6.193, 4.463 and 11.854, respectively, allP<0.05). After chemotherapy, HIF-1 and NF-κB expressions in cervical cancer tissues decreased, but the expression of PHD3 increased with statistical significance (χ2value was 6.112 and 7.532, respectively, bothP<0.05). The difference in chemotherapy effective rate between patients with positive expressions of PHD3, HIF-1 and NF-κB and those with negative expressions of these three was significant (χ2value was 11.726 and 7.205, respectively, bothP<0.05).Conclusion PHD3, HIF-1 and NF-κB may be used as indexes to determine the invasion of cervical cancer and to prejudge the chemotherapy effect on the prognosis of cervical cancer.

cervical cancer；prolyl hydroxylase 3(PHD3)；hypoxia inducible factor 1(HIF-1)；nuclear factor-κB(NF-κB)

2014-08-21

寧波市科技局自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010A610048)

楊海濤(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事婦科及乳腺科病理診斷工作。

鐘惠珍，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.048

R737.33

A

1673-5293(2015)04-0797-03