多肽合成研究進展△

曲朋，宋利，趙好冬，胡學生，孫佳明，張輝

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

·綜述·

多肽合成研究進展△

曲朋，宋利，趙好冬，胡學生，孫佳明，張輝*

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

多肽是一類生物活性很高的物質。本文從化學合成和生物合成兩個方面綜述了多肽的合成，介紹了固相合成、液相分段合成法、施陶丁格連接、天然化學連接、光敏感輔助基連接、可去除輔助基連接、化學區域選擇連接、氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、組合化學法、酶解法、基因工程法、發酵法等合成方法的原理及其優缺點，對多肽合成方法的發展及其中藥資源領域的應用進行了展望，為相關研究提供參考。

多肽；合成；進展

多肽是一類介于氨基酸和蛋白質之間的物質，由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。已發現存在于生物體內的多肽達數萬種。多肽是一種蛋白質的結構片段，能起到蛋白質的活性基團作用，是人體新陳代謝、調節活動的重要物質。通過研究多肽的結構與功能之間的關系，進而了解多肽中各氨基酸系列的功能。在進行化合物的設計時，盡可能選擇短肽，以便提高其生理活性，并且減少臨床不良反應。在美國FDA1999年允許大豆蛋白制品標注可以預防心血管疾病的功能之后，隨著人們對多肽中各氨基酸系列功能了解的不斷深入及多肽藥物和保健品的持續高速發展、多肽合成技術的日益成熟，越來越多的活性多肽已被開發并廣泛應用于醫藥領域，多肽藥物的開發越來越受到人們的重視，其市場需求也在日益增加。本文對近年來多肽的合成方法與研究進展進行綜述[1-5]。

1 多肽合成的分類

多肽的合成主要分為兩條途徑：化學合成和生物合成。

化學合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，合成時應將不需要反應的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應，這樣保證了合成目標產物的定向性。多肽的化學合成又分為液相合成和固相合成。多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發展迅速，在多肽和蛋白質合成領域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據多肽片段的化學特定性或化學選擇性，多肽片段能夠自發進行連接，得到目標多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。1963年，美國著名生物化學家Merrifield提出了固相合成法，開展了多肽固相合成，即將氨基酸的C末端(羧基端)連接在不溶樹脂上，然后在此樹脂上依次進行氨基酸的縮合、延長肽鏈。固相合成方法可分為叔丁氧羰基(Boc)方法和9-芴甲基氧羰基(Fmoc)方法。人們以多肽的液相和固相合成方法為基礎又發展了氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、組合化學法等。

多肽的生物合成方法主要包括發酵法、酶解法，隨著生物工程技術的發展，以DNA重組技術為主導的基因工程法也被應用于多肽的合成。

2 多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重復添加的過程，通常從C端向N端(氨基端)進行合成。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個氨基酸C端通過共價鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點，經過脫去氨基保護基和過量的已活化的第二個氨基酸進行反應，接長肽鏈，重復操作，達到理想的合成肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化，獲得目標多肽[6]。

2.1 Boc合成法

Boc方法是經典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護基，芐醇類作為側鏈保護基，Boc的脫除通常采用三氟乙酸(TFA)進行。合成時將已用Boc保護好的N-α-氨基酸共價交聯到樹脂上，TFA切除Boc保護基，N端用弱堿中和。肽鏈的延長通過二環己基碳二亞胺(DCC)活化、偶聯進行，最終采用強酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc合成法中，為了便于下一步的合成，反復用酸進行脫保護，一些副反應被帶入實驗中，例如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側鏈在酸性條件不穩定等[7]。

2.2 Fmoc合成法

Carpino和Han以Boc合成法為基礎發展起來一種多肽固相合成的新方法—Fmoc合成法。Fmoc合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護基。其優勢為在酸性條件下是穩定的，不受TFA等試劑的影響，應用溫和的堿處理可脫保護，所以側鏈可用易于酸脫除的Boc保護基進行保護[8]。肽段的最后切除可采用TFA二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成，避免了采用強酸[9]。同時，與Boc法相比，Fmoc法反應條件溫和，副反應少，產率高，并且Fmoc基團本身具有特征性紫外吸收，易于監測控制反應的進行[10-11]。Fmoc法在多肽固相合成領域應用越來越廣泛。

2.3 多肽固相合成法存在的問題

多肽固相合成法歷經數十年的發展，經過不斷改進和完善，雖然已經能夠合成很多具有生物活性的多肽和蛋白質，但其本身還存在著很多問題與缺陷，如直接合成的序列短、所需時間長、合成的效率和純度低、成本高等，這些問題都限制了多肽固相合成法的應用范圍。

2.3.1 合成多肽的序列短 自從B Merrifield發明了多肽固相合成法后，多肽的化學合成成為蛋白質大量重組表達的有效輔助工具，被廣泛應用于結構生物學、免疫學、蛋白質工程和生物藥物研究中。盡管在肽鏈合成后的性質、分析等方面都有很大提高，但是當肽鏈殘基大于30個，尤其超過50個時，肽鏈的合成就會受到一定程度的制約。這是由于在多肽固相合成時，聚合物的局限在于激活羧基時，合成肽的濃度較低，即使使用疊氮法可以有效防止外消旋的發生，但反應仍相對緩慢[12]。因此，多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成(30個氨基酸以內，少數為50個氨基酸以內)。大片段多肽的合成，可以應用基因工程法、液相合成法等。

2.3.2 合成時間長 經過四十多年的發展，多肽固相合成的速率取得了很大提高，但是相對其他合成方式(如生物合成法)來說，肽鏈的合成速率仍然很慢。每結合上一個氨基酸大約需要20～120 min[13]，平均一個九肽的合成需要5 h以上[14]。另外，當合成結構較復雜的多肽序列時，鏈的結合時間更長。

2.3.3 合成效率及純度低，成本高 對于富含二硫鍵和堿性氨基酸殘基的多肽固相合成，即使是在30個氨基酸以內，仍比較困難，一部分多肽不能成功合成。隨著氨基酸數量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增長，目的肽的純度相應降低，后續的純化和重復性愈加困難。合成多肽的樹脂和保護氨基酸等原料昂貴，多肽合成的成本高，還不能完全滿足作為藥物商業化生產的要求。

2.3.4 合成試劑的毒性大 DCM、DMF為多肽固相合成的首選試劑，其應用量大，毒性高，對身體及周邊環境危害大。這些有機化學試劑成為廢液后均需要報環保局進行處理。在合成過程中應用的儀器大多可在全封閉條件下進行，但其排出的廢氣、廢液等，對環境仍有一定的污染，不能保證百分百安全。而那些不是全封閉進行的合成反應，有毒試劑對環境的危害更大。因此，隨著多肽固相合成法的發展與廣泛應用，研制開發出新型的、危害小的合成試劑的需求越來越迫切。

3 多肽液相分段合成

隨著多肽合成的發展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性，自發連接成長肽的合成方法)在多肽合成領域中的作用越來越突出。其特點在于可以用于長肽的合成，并且純度高，易于純化。多肽液相分段合成主要分為天然化學連接和施陶丁格連接。天然化學連接是多肽分段合成的基礎方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學連接方法的應用范圍。天然化學連接方法的延伸包括化學區域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接。施陶丁格連接方法是另一種基礎的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路。正交化學連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率[15-16]。

3.1 天然化學連接

天然化學連接方法能夠簡單有效地實施多肽片段的連接。Kent等[17-18]將C端為硫酯的多肽片段與N端為Cys殘基的多肽片段在磷酸鹽緩沖液中進行反應，從而得到以Cys為連接位點的多肽。反應步驟如下：C端的硫酯與N端Cys殘基的側鏈巰基進行酯交換反應，生成新的硫酯中間體，此中間體自發形成過渡態五元環，繼而又迅速進行酰基遷移，最后形成了以Cys為連接位點的多肽產物。

Tam等[19]利用天然化學連接技術制備了含多個Cys殘基的環狀蛋白；Shin等[21]成功地合成出具有抗菌活性的糖蛋白；Duhee等[22]通過兩段縮合和三段縮合的途徑合成了一種含46個氨基酸殘基，分子結構穩定的蛋白質Crambin;Regula等利用該方法合成了含69個氨基酸殘基的前神經多肽-proNPY；Gapbor等[23]也利用該方法成功合成了第一個半合成的絲氨酸蛋白酶-SGT。

3.2 化學區域選擇連接

化學區域選擇連接方法，是擬Cys位點的連接技術，即以2-巰芐基(2-mercaptobenzyl)作為輔助基與硫酯發生親核反應。通過給電子基團的引入，可增加芳環上的親核性和電子濃度，從而提高限速步驟、硫酯交換反應的速率及輔助基對酸的敏感度，這大大加快了片段間的縮合速度，同時也有利于輔助基的脫除。

Liang等[24]利用化學區域連接技術，以丙氨酸(Ala)-甘氨酸(Gly)為位連接位點，合成出了環狀抗生素小菌素J25；John等[25]以賴氨酸(Lys)-Gly為位連接位點，成功合成了含有62個氨基酸殘基的Scr同源域-3(SH-3)；Francesco等[26]也利用該方法合成了新甘油共軛體和對寡聚糖的模擬。

3.3 可去除輔助基連接

化學區域選擇連接方法縮合的多肽片段是無側鏈保護片段，在合成時，須用強酸，如HF脫去側鏈保護基和樹脂。但產物肽段對酸不穩定，易受到強酸的影響。在輔助基選擇的研究中發現，苯胺衍生物Nα-(1-苯基-2-巰乙基)輔助基團不僅具有對強酸保持穩定，還具有提高片段間縮合速率的優點，使得N端多肽片段較易合成，由此衍生出新的連接方法—可去除輔助基連接。Paolo等[27]利用可除去輔助基連接方法合成出了TATA結合蛋白-TBP-A、巨噬細胞趨化蛋白-1(Mcp-1)、Mouse Larc等；另外，Raffaele等[28]在該方法的研究過程中還發現，在一定條件下Cu+和Cu2+可促進縮合反應的進行。

3.4 光敏感輔助基連接

在輔助基的研究中發現O-硝基芐基(O-nitrobenzyl)不穩定，尤其在光照條件下，為了得到更柔和的、易于除去且穩定的輔助基，將O-硝基芐基(O-nitrobenzyl)與巰乙基相連接，得到新的輔助基-NA-2-巰基-1-(2-硝基苯)乙基，也稱Mnpe輔助基。該輔助基具有很強的親核性，不僅有很高的縮合率，而且在光照條件下易分解，輔助基易于脫除。Torus等[29]使用該方法合成了具有20個氨基酸殘基的多肽，證實了Mnpe輔助基作為合成多肽輔助基的可行性，并且大大提高了產物的純度。

3.5 施陶丁格連接

Staudinger等[30]以疊氮反應為基礎，發展了施陶丁格連接方法，該方法與天然化學連接方法一樣，都是多肽片段縮合的基礎。施陶丁格連接是以C端的膦硫酯與N端的疊氮化合物反應，生成具有親核性氮的中間體—亞氨正膦，亞氨正膦分子自身發生分子內重排，得到酰胺膦鹽，酰胺膦鹽再水解得到目的多肽和膦氧化物[31]。

正交化學連接是施陶丁格連接方法的改進，是通過將過渡態結構縮小，減小親核性的酰亞氨中的氮與親電子性的硫酯中碳的距離，提高產物的產率。在正交化學連接研究中發現，亞甲基取代輔助基中的苯基，降低了膦的親核性，使其對氧氣的敏感度降低，減小了氧化反應的可能性。因此，同樣在Gly位點進行縮合，其縮合率高達92%。另外，利用正交化學連接法成功地合成出含124個氨基酸殘基的核糖核酸酶A(RNase A)[32-33]。

4 其他多肽合成方法

4.1 氨基酸的羧內酸酐法(NCA)

氨基酸的羧內酸酐的氨基保護基也可活化羧基。NCA的原理：在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結合，反復進行。NCA適用于短鏈肽片段的合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術也較為通用[34]。

4.2 組合化學法

20世紀80年代，以固相多肽合成為基礎提出了組合化學法，即氨基酸的構建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學庫，并從中篩選出具有某種理化性質或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。組合化學法的合成策略主要包括：混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學法的最大優點在于可同時合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體。Dubs等[35]利用化學選擇平行方法，得到了含有102種兩親性黑色素細胞刺激素(R-MSH)的類似物的肽庫。經藥理測試發現，其中84種化合物的AMPs的誘導性高于R-MSH促效劑Melitane。提高合成化合物組合庫的分子多樣性及開發與之配套的快速分析和鑒定手段是目前迫切需要解決的問題。

4.3 酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白質和動物蛋白質，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產量低、投資大、周期長、污染嚴重，未能實現工業化生產。鄒遠東教授等[36]利用酶解法開發出大豆多肽、大豆寡肽、鮑魚肽、海參肽、苦瓜肽、魚翅肽、燕窩肽等一系列多肽產品。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質原有的營養價值，并且可以獲得比原蛋白質更多的功能，更加綠色，更加健康。

4.4 基因工程法

基因工程法主要以DNA重組技術為基礎，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛生，原料來源廣泛和成本低等優點，但因存在高效表達，不易分離，產率低的問題，難以實現規模化生產。

4.5 發酵法

發酵法是從微生物代謝產物中獲得多肽的方法。雖然發酵法的成本低，但其應用范圍較窄，因為現在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細菌肽。

5 結束語

隨著市場尤其醫療衛生方面對多肽產品需求的日益增加，多肽合成產業在迅速地發展，更多的多肽合成企業在建立。此外，中藥資源的日益減少，使許多以多肽類為主要成分的中藥應用受到限制，不能滿足各個領域的需求。多肽合成技術的出現和不斷完善很好地解決了這個問題。對于已知完整結構的多肽，應用多肽合成技術進行合成，既保護了中藥資源又滿足了市場需求。多肽產業的高速發展同樣帶動了合成技術的發展，需要更加方便、有效、成本低、毒害小、產率高、易于實現規模化生產的合成技術以及分離純化技術。作為21世紀重點研究領域，多肽產業的發展也面臨著研發力量薄弱、仿制、技術水平低等問題，應通過加大研發投入，完善原有技術，挖掘新技術等途徑，保證多肽產業高效、安全地發展。

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ResearchProgressofPeptideSynthesis

QUPeng,SONGLi,ZHAOHaodong,HUXuesheng,SUNJiaming,ZHANGHui*

(ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,130117 ,China)

Peptide is a kind of important biological active substance. This article summarized from two aspects of chemical synthesis and biosynthesis of synthetic polypeptides. The principle advantages and disadvantages of solid-phase synthesis, liquid segment synthesis, Staudinger ligation, native chemical ligation，enzymatic method, genetic engineering and fermentation were introduced. The development of peptide synthesis methods and applications in the field of traditional Chinese medicine resources were prospected.

peptide；synthesis；progress

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.023

2014-10-27)

國家自然基金項目—肽鏈熱振蕩理論對動物類中藥材炮制機理的研究(81073048)

*

張輝，教授，博士生導師，研究方向：藥用動物基礎與應用開發研究；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com