探索運用流式細胞儀來檢測細胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮陽市濮陽油田總醫院檢驗科，河南 濮陽 457001）

探索運用流式細胞儀來檢測細胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮陽市濮陽油田總醫院檢驗科，河南 濮陽 457001）

目的 探討運用流式細胞儀來檢測細胞凋零的方法。方法 以流式細胞儀檢測細胞的DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度，對凋零細胞的特點進行分析。結果 DNA含量檢測敏感度、特異性欠佳；磷酯酰絲氨酸測定對細胞凋零的早期、晚期情況可做出良好反應；線粒體膜電位、鈣離子濃度可反應出細胞凋零時的生理指標。結論 每種檢測方法均存在一定的優缺點，在使用流式細胞儀檢測細胞凋零時，應具有針對性的檢測方法進行選擇，提高檢測效率。

流式細胞儀；細胞凋零；DNA含量；磷酯酰絲氨酸；線粒體膜電位

細胞凋零又稱為細胞程序性死亡，細胞凋零時，往往伴有形態變化及生化改變。了解細胞凋零過程對于維持機體的正常發育、促進新陳代謝是具有重要意義的，細胞凋零是具有一項正向意義的機體內部活動［1］。但由于細胞凋零與細胞壞死之間存在大量的相似點，因此，了解一個細胞具體的凋零過程是十分有必要的。目前，常通過流式細胞儀來檢測細胞凋零的過程，該種儀器可對細胞進行定量分析和分選。在此次調查中，筆者主要從測定DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度等方面來了解細胞凋零過程中所發生的一系列生化改變特性，并篩選出檢測細胞凋零的最適方法。具體情況如下。

1　材料與方法

1.1試驗材料：人臍靜脈內皮細胞由上海博古生物提供，脂多糖由Sigma公司生產提供，Annexin V-FITC/PI細胞凋零檢測試劑盒由Roch公司生產提供，JC-1、羅丹明123膜電位檢測試劑盒由碧云天公司生產提供，Fulo-3鈣離子濃度檢測試劑盒由碧云天公司生產提供。

1.2細胞培養方法：此次試驗主要通過DMEM/F12培養基對細胞進行培養，使細胞貼壁生長直至融合。細胞消化傳代使用1.25 g/L胰酶，并從中選擇生長良好的人臍靜脈內皮細胞進行試驗。

1.3實驗組與對照組的設定：實驗組細胞中加入20 mg/L的LPS，并對細胞進行一段時間的刺激。對照組細胞中不加入藥物，使兩組細胞的最終培養濃度為5×105個/mL。

1.4試驗方法

1.4.1DNA含量測定：以PBS對胰酶消化細胞進行洗滌，通常洗滌2次，后收集細胞。加入預冷70%的乙醇溶液，于4 ℃恒溫環境下放置過夜。離心法收集所需細胞，并加入50 μg/mL的溴化乙錠及100 μg/mL的RNaseA，在4 ℃環境中避光培養30min后以流式細胞儀進行細胞檢測。

1.4.22磷脂結合蛋白AnnexinV-FITC/PI檢測法：以PBS對胰酶消化細胞進行洗滌，通常洗滌2次，后收集細胞。于細胞內加入經FITC所標記的AnnexinV，并在室溫環境下避光培養30min。后加入PI，于避光環境下再次培養反應5min。最后加入Buffer（加入量根據細胞量確定）并以流式細胞儀進行細胞檢測。

1.4.3線粒體膜電位檢測：以PBS對胰酶消化細胞進行洗滌，通常洗滌2次，后收集細胞。以濃度為1mol/L的Rhodamine對細胞進行染色，于37 ℃環境下放置30min，使得細胞染色均勻，而后通過流式細胞儀進行細胞檢測（進行細胞熒光強度檢測）。

1.4.4鈣離子濃度檢測：以PBS對胰酶消化細胞進行洗滌，通常洗滌2次，后收集細胞。細胞內加入5μmol/L的Flou-3-AM，并在37 ℃恒溫條件下進行負載至Flou-3進入至細胞內部。對于未負載成功的熒光探測劑進行洗滌，并通過流式細胞儀對細胞進行檢測。

2　結 果

2.1DNA含量檢測結果：細胞發生凋零時，可激活核酸內切酶，致死DNA出現斷裂。以PI對細胞進行染色，可顯示出“亞二倍峰”，及所謂的凋零峰。通過凋零峰，可對細胞凋零的百分率進行計算。在此次試驗中，實驗組與對照組應存在LPS刺激的差異，可見實驗組DNA斷裂的發生率明顯高于對照組。因此，可通過DNA含量檢測來確定細胞凋零率。

2.2磷脂結合蛋白AnnexinV-FITC/PI檢測法檢測結果：在細胞凋零早期，細胞膜可發生重排反應。重排反應可使得磷酯酰絲氨酸由細胞膜內側翻轉至細胞膜表面。AnnexinV可與翻轉至細胞外部的磷酯酰絲氨酸相結合，反應細胞早期凋零時的情況。而PI中晚期凋零細胞及死亡細胞進行染色反應，PI作為核酸染料，可直接穿透細胞膜對細胞核進行染色，使其細胞核呈紅色。因此，可通過AnnexinV-FITC/PI區分細胞的早、中、晚及死亡期。

2.3線粒體膜電位檢測檢測結果：當膜電位下降時，可表示細胞處于凋零早期。當線粒體膜電位較低時，JC-1以單體形式存在。經檢測，此時其所激發的波長為488 nm、發射的波長為529 nm，所呈現出的為綠色熒光。當線粒體膜電位較高時，JC-1以聚合體形式存在。經檢測，此時其所激發的波長為490 nm、發射的波長為590 nm，所呈現出的紅橙色熒光。因此，可通過線粒體膜電位的檢測結果反映出細胞凋零早期。此次試驗中，實驗組細胞熒光顯示逐漸由紅橙色轉變為綠色。

而羅丹明123染料是一種線粒體跨膜電位指示劑，其可直接透過細胞膜。當細胞正常時，羅丹明123染劑可通過線粒體跨膜電位直接進入線粒體機制，使得熒光強度明顯減弱或消失。當細胞發生凋零時，線粒體膜可受到破壞，并可重新釋放出線粒體，熒光強度增加，并主要放射出黃綠色熒光?？梢姡_丹明123染料檢測也可直接反映出細胞凋零的情況。此次實驗組細胞黃綠色熒光強度明顯增加。

2.4鈣離子濃度檢測結果：Flou-3-AM不能與游離于細胞外的Ca2+相結合，但其進入細胞后，其可脫去“-AM”。形成脂溶性的Flou-3，Flou-3可與細胞內游離的鈣離子相結合，并可釋放出高于本身40倍左右的熒光強度。因此，通過Flou-3-AM檢測，可有效區分細胞內外的鈣離子含量。當細胞發生凋零時，細胞外的Ca2+會出現內流情況，使得細胞內的Ca2+含量明顯的增多。此次實驗組的細胞的黃綠色熒光強度明顯增加。

3　討 論

對于細胞凋零檢測，每種檢測方法均存在一定的局限性，如DNA含量檢測法，僅可反應細胞的凋零率，而并不能反應出細胞的凋零階段，其檢測特異性欠佳［2］。因此，在進行細胞凋零檢測時，需進行針對性的方法選擇，提高檢測效率。筆者對每種檢測方法的缺點進行一定的總結，具體如下［3-4］：①DNA含量檢測。DNA含量檢測特異性較低，除了凋零細胞外，機械損傷性細胞或本身細胞內DNA含量就較低的細胞均可出現凋零峰，因此，單獨的DNA含量檢測并不能確定細胞為凋零細胞。②Annexin-V-FITC/PI檢測法。該種檢測方法可對細胞凋零的分期階段進行顯示，但卻無法分辨出凋零或壞死的細胞，由于壞死細胞的細胞膜通透性也明顯的增強，因此，在進行檢測時需控制凋零細胞及壞死細胞的比例。③線粒體膜電位檢測。細胞凋零與膜電位下降呈正相關關系，這是一個不可逆轉的過程。④鈣離子濃度測定。鈣離子內流的情況不僅僅在于發生細胞凋零，其檢測結果易受到外界環境因素的影響。

總之，結合多種方法進行細胞凋零檢測，可明顯提高檢測準確度。同時，在進行檢測前對檢測方法進行針對性的選擇，可有效提高檢測效率。

［1］ 顧芳，秦宜德，羅欣，等.細胞凋亡檢測方法的研究進展［J］.醫學信息，2014，32（10）：517-518.

［2］ 孫建平，譚竹鈞，韓雅莉，等.細胞凋亡檢測方法的研究進展［J］.生物技術通報，2012，（1）：54-59.

［3］ 高楓.細胞凋亡檢測方法及其研究進展［J］.陜西醫學雜志，2013，42（8）：1082-1083.

［4］ Yu S，Deng G，Qian D，et al Detection of apoptosis-associated microRNA in human apheresis platelets during storage by quantitative real-time polymerase chain reaction analysis［J］. Blood Transfus，2014，12（4）：541-547.

R329.2

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1671-8194（2015）10-0077-02