解毒通絡(luò)保腎法對糖尿病腎病大鼠腎小球Notch胞內(nèi)域表達(dá)的影響

樸松蘭王倩涵李 蓓鄭晶晶牟美佳劉美春姜茗宸

（1 長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117；2 長春中醫(yī)藥大學(xué) 護(hù)理學(xué)院2011級，吉林 長春 130117）

解毒通絡(luò)保腎法對糖尿病腎病大鼠腎小球Notch胞內(nèi)域表達(dá)的影響

樸松蘭1王倩涵2李 蓓2鄭晶晶2牟美佳2劉美春2姜茗宸2

（1 長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117；2 長春中醫(yī)藥大學(xué) 護(hù)理學(xué)院2011級，吉林 長春 130117）

糖尿病腎病；解毒通絡(luò)保腎法；腎功能衰竭；實(shí)驗(yàn)研究

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）在臨床上以持續(xù)性蛋白尿和進(jìn)行性腎功能減退并最終進(jìn)展至終末期腎功能衰竭為特征，是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。在我國，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，目前約有4千萬人面臨糖尿病威脅，而在終末期腎功能衰竭的患者中，DN所占比例也正逐漸增高。DN不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還常常危及患者生命，因此探討DN發(fā)生發(fā)展機(jī)制、找到針對DN的有效治療方法顯得非常有意義。

近年來，隨著對腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能改變的深入研究，證實(shí)足細(xì)胞損傷是糖尿病蛋白尿產(chǎn)生和腎小球硬化的關(guān)鍵因素，多數(shù)證據(jù)支持足細(xì)胞凋亡是糖尿病足細(xì)胞減少的主要原因，與Notch通路激活密切相關(guān)，而該通路在DN的發(fā)病、發(fā)展過程中起到重要作用［1］。目前對Notch通路的研究主要集中在腫瘤發(fā)病學(xué)和胚胎發(fā)育領(lǐng)域，對DN腎小球病變研究甚少。

解毒通絡(luò)保腎法是我校國家名老中醫(yī)南征教授在50多年來從事DN臨床與中醫(yī)理論研究基礎(chǔ)上提出的消渴腎病之治法，有很好的療效，尤其在改善蛋白尿方面效果顯著［2-3］。蛋白尿與腎小球足細(xì)胞脫落（主要是凋亡）而致的濾過膜通透性升高有密切關(guān)系，解毒通絡(luò)保腎法改善蛋白尿的作用可能與對足細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)，這種保護(hù)作用可能是通過對Notch通路的抑制來減少足細(xì)胞凋亡或脫落，為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，具體如下：

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周普通級雄性Wistar大鼠60只（體質(zhì)量180～230 g），由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2主要試劑和藥品：鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司，解毒通絡(luò)保腎膠囊由長春中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。

1.2方法

1.2.1大鼠DN模型制備方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，禁食、不禁水12 h，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組10只、DN模型制作組50只。以單次、大劑量腹腔注射STZ方法制備DN模型（劑量為STZ 52 mg/kg體質(zhì)量，臨用前用0.1 M枸櫞酸緩沖液溶解，溶液pH 4.2），正常對照組僅腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。注射STZ 72 h后，從尾靜脈采血，檢測空腹血糖，將血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上大鼠視為DN模型制備成功。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法：將造模成功的36只DN大鼠，按體質(zhì)量、血糖隨機(jī)分為DN模型對照組、解毒通絡(luò)保腎法組和苯那普利組（西藥對照）。本實(shí)驗(yàn)具體分組情況及給藥方法如下：正常對照組（10只）；DN模型對照組（12只）；解毒通絡(luò)保腎法組（12只），每日以5 g/kg體質(zhì)量劑量灌胃解毒通絡(luò)保腎膠囊混懸液；苯那普利組（12只），每日以15 mg/kg體質(zhì)量劑量灌胃苯那普利混懸液。正常對照組和DN模型組灌服等體積生理鹽水，連續(xù)給藥8周，每日上午1次。

1.3觀察指標(biāo)：藥物干預(yù)8周末，處死動(dòng)物，打開腹腔，快速取出腎臟，按冠狀面切開，迅速浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，常溫保存。

1.3.1HE染色觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)：將切片脫蠟至水，常規(guī)HE染色、封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組化方法檢測NICD腎臟表達(dá)，棕黃色染色區(qū)域?yàn)殛栃裕簩⑶衅撓炛了琒P免疫組化法染色，光鏡下觀察。

2　結(jié) 果

2.1腎臟HE染色觀察結(jié)果：正常對照組大鼠腎小球均無明顯異常，絕大部分毛細(xì)血管袢開放，血管壁正常，系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）未見明顯增多，近曲小管結(jié)構(gòu)正常。DN模型組大鼠腎小球內(nèi)部分毛細(xì)血管受壓而塌陷，系膜區(qū)ECM無明顯增多，所見近端小管上皮細(xì)胞高度水腫。解毒通絡(luò)保腎組和苯那普利組大部分毛細(xì)血管袢開放，系膜區(qū)ECM無明顯增多，偶見近端小管上皮細(xì)胞水腫。

2.2腎臟NICD免疫組化染色觀察結(jié)果：NICD免疫組化染色，棕黃色著色區(qū)域?yàn)殛栃裕?xì)胞核表達(dá)為Notch通路活化標(biāo)志。正常對照組腎小球內(nèi)出現(xiàn)少量陽性表達(dá)，主要為胞質(zhì)表達(dá)；部分腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色著色區(qū)域，但主要以胞質(zhì)為主，細(xì)胞核表達(dá)極少。DN模型組大鼠腎小球內(nèi)出現(xiàn)較多棕黃色著色區(qū)域，細(xì)胞核表達(dá)多見；腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)陽性表達(dá)增多。與DN模型對照組比較，解毒通絡(luò)保腎組腎小球內(nèi)細(xì)胞核陽性表達(dá)較少，腎小管上皮細(xì)胞陽性表達(dá)主要以胞質(zhì)為主。苯那普利組腎小球內(nèi)細(xì)胞核陽性表達(dá)亦較少，與解毒通絡(luò)保腎組表達(dá)無明顯差別。

3　討 論

Notch信號通路是一種相對保守的、廣泛存在于細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)通路，該通路在細(xì)胞的增生和分化中起到了關(guān)鍵性的作用。Notch信號由受體與配體相互作用而激活，配體誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象變化，先后在細(xì)胞外金屬蛋白酶和γ-分泌酶（γ-secretase）的作用下釋放出Notch胞內(nèi)域NICD，NICD 是Notch信號的活化形式。NICD進(jìn)入細(xì)胞核后，激活Notch通路下游基因Hes和Hey，從而影響細(xì)胞分化、增殖和凋亡。目前Notch信號通路在腎臟中的研究，已從腎臟的發(fā)育轉(zhuǎn)到腎小球疾病，該通路可能在足細(xì)胞的凋亡過程中起到了關(guān)鍵性作用。足細(xì)胞損傷是腎小球疾病發(fā)展的重要因素，可引起嚴(yán)重的蛋白尿。Notch信號通路的激活可能是足細(xì)胞病理損傷的一個(gè)常見機(jī)制，受損傷足細(xì)胞的最終結(jié)局依賴于Notch信號通路激活水平。足細(xì)胞數(shù)量減少會造成濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失，發(fā)生蛋白尿，而尿蛋白的增加將誘導(dǎo)腎小球纖維化和腎小管萎縮。在健康的成人腎臟腎小球內(nèi)幾乎檢測不到Notch活化，NICD細(xì)胞核表達(dá)是該通路激活的標(biāo)志。

解毒通絡(luò)保腎法方藥選榛花、大黃為君藥，重在解毒、排毒；選黃連、雙花（清熱解毒，燥濕祛濁）和黃芪、丹參（益氣通絡(luò)，扶正抗毒）為臣藥，共同起到增強(qiáng)君藥的解毒作用；選生地、枸杞為佐藥，取其養(yǎng)陰生津、滋補(bǔ)肝腎之用；地龍走竄入絡(luò)為使藥。諸藥合用，共奏解毒通絡(luò)、化瘀保腎之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解毒通絡(luò)保腎法膠囊能夠改善DN大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)，減少腎小球內(nèi)細(xì)胞核NICD表達(dá)。該結(jié)果提示，解毒通絡(luò)保腎法能夠抑制糖尿病腎病大鼠腎小球內(nèi)Notch通路激活，更具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究、探索。

［1］Niranjan T，Bielesz B，Gruenwald A，et al.The Notch pathway in podocytes plays a role in the development of glomerular disease［J］.Nat Med，2008，14（3）：290-298.

［2］何澤，樸春麗，陳曦，等.解毒通絡(luò)保腎法治療35例糖尿病腎病臨床研究［J］.中國實(shí)用中醫(yī)藥，2011，6（6）：165-167.

［3］何澤.解毒通絡(luò)保腎法治療糖尿病腎病驗(yàn)案［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2010，8（9）：65.

R587.2

B

1671-8194（2015）28-0040-02

項(xiàng)目受吉林省中醫(yī)藥管理局資助（2012-042）