動物中DNA甲基轉移酶2研究進展

綜述與專論

動物中DNA甲基轉移酶2研究進展

呂丹，張連峰

(北京協和醫學院，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京100021)

【摘要】哺乳動物中DNA甲基轉移酶家族包括DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)，DNA甲基轉移酶2(DNA methyltransferase 2, Dnmt2，也叫做天冬氨酸tRNA甲基轉移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1))和 DNA甲基轉移酶3(DNA methyltransferase 3, Dnmt3)。Dnmt2在進化史上比Dnmt1和Dnmt3更古老，存在于更多物種中，包括植物、真菌、寄生蟲、昆蟲、魚類、兩棲類、鳥類和哺乳動物，但其生化學機制和生物學功能仍不十分清楚，已有研究報道也存在許多矛盾之處。本文僅就Dnmt2在動物中的研究，包括其結構特點，對RNA甲基化的作用及相關生物學表型的研究進展作一總結。

【關鍵詞】Dnmt2；甲基化；RNA；功能

[基金項目]北京市自然科學基金(7122111)；國家自然科學基金(31301932)。

[作者簡介]呂丹(1980-)，女，副研究員，研究方向：心肌病及高血壓相關動物模型建立及相關調節基因功能研究。E-mail: lvd@cnilas.org。

[通訊作者]張連峰，E-mail: zhanglf@cnilas.org。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.012

Research progress of DNA methyltransferase 2 in animals

LU Dan, ZHANG Lian-feng

(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Heath,

Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &

Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)

Abstract【】There are three members in DNA methyltransferase family of mammals, DNA methyltransferase 1 (Dnmt1), DNA methyltransferase 2 (Dnmt2, also named tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1) and DNA methyltransferase 3 (Dnmt3). Dnmt2 is immemorial than Dnmt1 and Dnmt3, and it exists in plant, fungi, parasites, insects, fish, amphibians, aves and mammalia, however, its biological function is still unknown. The structure characteristics, RNA methylation, function analysis and scientific problems are discussed in this paper.

【Key words】Dnmt2; Methylation; RNA; Function; Animals

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見的復制后修飾，是基因組信息流調控的重要方式，參與染色體結構維持、基因調控、RNA降解、基因印記和X染色體滅活等重要的生理生化過程，并通過基因組信息流的調控影響胚胎發育、組織維持、衰老和疾病發生。哺乳動物中有兩類DNA甲基轉移酶，第一類是DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)負責DNA甲基化水平的維持。第二類包含DNA甲基轉移酶3A(DNA methyltransferase 3A, Dnmt3A)，DNA甲基轉移酶3B(DNA methyltransferase 3B, Dnmt3B)和DNA甲基轉移酶3L(DNA methyltransferase 3L, Dnmt3L)，負責DNA的初始甲基化。

DNA甲基轉移酶家系中還有一個成員，即DNA甲基轉移酶2(DNA methyltransferase 2, Dnmt2)，也叫做天冬氨酸tRNA甲基轉移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1)。Dnmt2在進化史上比Dnmt1和Dnmt3s更古老，存在的物種更廣泛，包括植物、真菌、寄生蟲、昆蟲、魚類、兩棲類、鳥類和哺乳動物[1]，其生化學機制和生物學功能一直不十分清楚，已有研究報道也存在許多矛盾之處。

1998年Okano M和Yoder JA兩個研究小組發現，在小鼠和人的細胞中有一個包含大部分甲基化轉移酶功能域的基因，與酵母(yeast Schizosaccharomyces)的 pombe基因有很高的同源性，并命名為Dnmt2[2-3]。同年Van den Wyngaert等用Northen blot技術研究了Dnm2組織表達譜，發現其表達廣泛，但表達水平很低[4]，主要存在于肌肉、發育中的胚胎內臟、卵巢囊腫以及增殖中的睪丸細胞中[5]。Dnmt2在斑馬魚中定位于細胞質中[6]，而在果蠅中則存在于胞漿和核內，細胞內定位顯示大量的Dnmt2結合于核基質處，在有絲分裂前期進入細胞核內，呈現類紡錘體式定位，并在細胞分裂過程中可觀察到與DNA結合[5]，這些研究結果預示著Dnmt2可能有多方面的功能。

1Dnmt2的結構特點

Dnmt2與Dnmt1及Dnmt3s比較(圖1，見封三)，缺少N端的調節功能域，保留了由10個進化保守的基序(motifs)構成的催化功能域和靶結合域[4，7]。

本文綜合了NCBI基因數據庫(Gene)中人類(Homosapiens)Dnmt2蛋白序列(NP_004403.1)，大鼠(Rattusnorvegicus)Dnmt2蛋白序列(NP_001026813.1)，小鼠(Musmusculus)Dnmt2蛋白序列(NP_034197.3)和果蠅(Drosophilamelanogaster)Dnmt2蛋白序列(NP_477475.1)以及Reinhardt等綜述提供的有關信息[8]，列入圖2(見封三)中。通過對比分析可以看出，人類、大鼠及小鼠的Dnmt2 蛋白在基序VIII 和靶識別序列之間有一個60個氨基酸的序列，該序列在果蠅的Dnmt2 蛋白中卻不存在[9-10]。人類、大鼠、小鼠和果蠅的基序IV、基序VI 和靶識別序列中與催化活性以及底物結合相關的區域存在著5個高度相似區域。在基序VIII-IX區有41個保守的氨基酸，其中包含Cys-Phe-Thr三肽和Asp-Ile二肽, 這個區域與原核生物DNA甲基轉移酶的TRD結構域相一致[11]。人類、大鼠和小鼠的Dnmt2氨基酸序列高度相似，人類和大鼠的氨基酸殘基數相同，而小鼠在C端比人類和大鼠多出了25個氨基酸殘基。

2DNMT2與DNA甲基化無關

Dnmt2蛋白有一個十分保守的DNA(cytosine-5)甲基化轉移酶催化功能域，X射線結晶研究證實，人類的Dnmt2結構和細菌的高度相似，并且可以與DNA形成具有變性抗性的復合物[11]，純化的重組人Dnmt2在體外可以使DNA序列中0.5%的C堿基甲基化[12]。到目前為止，有幾個研究報告證實Dnmt2在哺乳類細胞、果蠅和痢疾阿米巴(parasiteEntamoebahistolytica)中有微弱的DNA甲基化活性[13-18]，但是，也有Dnmt2不參與DNA甲基化的研究報告，最早在一種線蟲(Pristionchuspacificus)中發現，Dnmt2沒有DNA甲基化的活性[19]。 Raddatz G等利用全基因組甲基化分析技術分析了果蠅和曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)這兩種只表達Dnmt2 動物的全基因組甲基化水平，證實這類動物的全基因組沒有明顯的DNA甲基化譜。Dnmt2敲除和未敲除的果蠅基因組甲基化水平沒有明顯的區別，而在小鼠的胚胎細胞中，敲除了Dnmt1和Dnmt3，僅保留Dnmt2后不能維持DNA甲基化譜[20]。Zemach A和Takayama S等分別在斑馬魚和果蠅中失活Dnmt2，卻不影響其基因組的甲基化[21-22]。所以Dnmt2 不是一種DNA甲基化酶，已逐漸成為主流觀點。

3Dnmt2對內源RNA甲基化

Dnmt2不是一種DNA甲基化酶，而是一種RNA甲基化酶已被越來越多的實驗所證實。第一個被發現的Dnmt2的功能性底物RNA分子是tRNA(Asp)，Dnmt2能夠特異性甲基化tRNA(Asp)反密碼子環38C[23]。隨后證實除了tRNA(Asp)之外，tRNA(Val) tRNA(Gly) 和tRNA(Glu)也可被Dnmt2甲基化，并保護這幾種tRNA不被RNA酶降解[24-25]。同時敲除Dnmt2和NSun2這兩種RNA甲基化酶基因后，小鼠tRNA穩定性減低并導致蛋白合成受到抑制[26]。Dnmt2的作用不僅局限于tRNA甲基化，還具有廣泛的RNA甲基化活性。在小鼠中Kit 基因能改變毛色，但在Dnmt2敲除的小鼠中，Kit 基因具有通過表觀遺傳方式改變毛色的作用不復存在。用miR-124 microRNA抑制Sox9基因表達后小鼠會過度生長，但在Dnmt2敲除小鼠中，miR-124 microRNA對Sox9基因的抑制作用也同時被消除，說明Kit和miR-124 microRNA介導的表觀遺傳表型需要Dnmt2活性[27]。綜上，由于RNA甲基化分析技術局限性，目前發現的Dnmt2的RNA底物還十分有限，但是，研究已表明Dnmt2具有廣泛的內源RNA甲基化活性，并且在表觀遺傳中的重要作用。

Dnmt2在結構上不屬于DNA甲基轉移酶家系，與已經發現的RNA甲基轉移酶在序列和結構上沒有相似性，不是一種常規的RNA甲基轉移酶。為了闡明Dnmt2酶的催化機制，Jurkowski等突變了人Dnmt2的C24、C140、C287和C292等幾個在RNA甲基轉移酶中起作用的位點，結果不影響Dnmt2在tRNA(ASP)的C38 甲基化活性，但是突變了通常在DNA甲基化中起作用的一個谷氨酸殘基(E119)后，Dnmt2甲基化活性消失。說明Dnmt2是以DNA甲基化的方式催化RNA的甲基化[28]。他們進一步研究發現，Dnmt2主要作用于tRNA反義密碼的頸和環[29]，RNA的一段雙鏈區，比如tRNA的雙鏈“頸”，是不是Dnmt2與RNA結合所必需的結構仍有待實驗證實。

4Dnmt2對病源RNA作用

Dnmt2存在于原核生物和真核生物，包括植物、真菌、寄生蟲、昆蟲和哺乳動物的基因組中，可能是在長期進化篩選壓力下保留下的基因之一[1]。Dnmt2表達水平很低，但是在應激刺激時表達上調[30-31]。Durdevic等最近的研究發現，在敲除Dnmt2的果蠅中，固有免疫代償性的活化，而果蠅C病毒(DrosophilaC virus, DCV)在敲除Dnmt2的果蠅中有堆積的現象。Dnmt2可以結合DCV病毒RNA起到控制作用[32]。所以Dnmt2有可能是古老的病源防疫機制的因子之一[7]。

5動物中Dnmt2 相關生物學表型仍然不明確

Dnmt2既然是在長期進化篩選壓力下保留的基因，可以推測該基因具有十分重要的生物學功能。但是，目前在寄生蟲、昆蟲和哺乳動物的研究中，尤其在小鼠研究中尚未發現重要的Dnmt2相關生物學表型，然而，在人腫瘤細胞(Hela)和人胚胎腎細胞(HEK293)中Dnmt2過表達引起細胞死亡。表1總結了到目前為止，對Dnmt2基因生物功能的研究結果。

6展望

Dnmt2，尤其是在哺乳動物和人類中的作用尚有很多不解之處：(1)目前僅發現了幾種Dnmt2所引起的甲基化的RNA，那么Dnmt2對RNA的作用是全面性的還是局限性的？這需要不斷進步的RNA甲基化分析技術的支持。隨著Dnmt2引起的甲基化的RNA譜數據的積累，可逐步了解Dnmt2在基因組到RNA再到蛋白質及整個信息流的調控中發揮的作用。另外，Dnmt2以DNA甲基化轉移酶的方式對RNA起作用， Dnmt2與RNA的結合需要RNA雙鏈“頸”的結構嗎？仍需進一步證實。(2)Dnmt2在小鼠和人類的組織中表達都很低，Dnmt2是否在應急狀態下才表達以及其表達調控的機制現在都不清楚，同時Dnmt2在應激和抵抗病原感染中的重要性也需要深入研究。(3)Dnmt2在哺乳動物中的生物學功能，或者相關聯的表型是什么？需要Dnmt2基因過表達和基因敲除的動物模型對比研究，也需要在應急狀態下對比研究，僅一種Dnmt2基因敲除小鼠沒有明顯表型不能完全說明問題，此外，也需要Dnmt2基因過表達和基因敲除的其他物種，如大鼠等，來進一步確定其生物學功能。

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〔修回日期〕2014-12-08