分子生物學技術在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進展

于新友，李天芝，苗立中，唐 娜，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

分子生物學技術在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進展

于新友1，李天芝1，苗立中2，唐 娜2，沈志強1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

綜述了分子生物學技術在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷的4種方法（RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、RT-PCR與RFLP相結合方法、環介導等溫擴增方法）的研究進展，對豬瘟的凈化和防控有一定的參考價值。

分子生物學技術；豬瘟野毒；兔化弱毒；鑒別診斷

豬瘟(CSF)是黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內廣泛流行，其發病率和死亡率均高，對養豬業危害十分嚴重。世界動物衛生組織(OIE)在《國際動物衛生法典》中將其列為法定傳染病之一。疫苗接種是防控豬瘟的重要手段，我國研制的豬瘟兔化弱毒在世界上廣泛應用，對豬瘟的防控起到了重要的作用，但豬瘟弱毒疫苗株（HCLV）能在已接種的豬體內持續存在一段時間，這給CSFV野毒感染豬和HCLV接種豬的鑒別診斷帶來較大困難，再加上近年來，我國豬瘟的流行和發病特點發生了很大變化，出現了所謂 “非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，也給臨床診斷帶來了很大困難[1]。因此，準確區分豬瘟野毒株與兔化弱毒疫苗株的敏感、特異的鑒別診斷方法非常重要。筆者就鑒別豬瘟野毒株與兔化弱毒疫苗株的方法進行了綜述，以期對豬瘟病毒感染早期進行準確診斷，淘汰強毒感染豬，減少未感染的免疫豬被誤殺，為豬瘟的凈化和防控提供參考。

1??RT-PCR?方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優點在動物疾病診斷上得到了廣泛的應用。Li Y等[2]建立了能區分豬瘟強、弱毒的復合套式RTPCR診斷方法，該方法從HCLV和石門株強毒株基因組分別擴增出447和343 bp的特異性片段，從2種病毒基因組混合物中同時擴增出447和343 bp的特異性片段，該方法對BVDV、JEV、TGEV、PEDV、PRV、PCV2、PRRSV、PPV以及正常細胞基因組進行檢測時均為陰性，可以檢測出0.04 pg的CSFV RNA，用該方法檢測133份臨床樣品，結果有42份為強毒感染，18份為弱毒疫苗。胡建和等[3]根據GenBank中豬瘟病毒及近源病毒的基因組全序列，選擇特異保守區域設計了2對豬瘟病毒引物，建立了一種敏感性、特異性強、重復性好的鑒別豬瘟強毒和HCLV的多重RT-PCR鑒別診斷方法。該法從HCLV和石門強毒株的基因組中分別擴增出1條大小為492和178 bp的特異性片段，從強弱毒株混合物中1次擴增出2條大小為492和178 bp的特異性片段，對偽狂犬病病毒的擴增結果為陰性，能檢測出0.8 pg的豬瘟病毒RNA，應用試驗表明，8份疑似豬瘟病料中5份為強毒感染，2份為弱毒感染，1份為弱毒和強毒的混合感染。郭抗抗等根據GenBank中36株豬瘟病毒強毒株和HCLV株的基因序列，分別設計了針對CSFV強毒和HCLV株的特異性引物，建立了一種能區分CSFV強毒和HCLV的RTPCR檢測方法。該法可從CSFV強毒株和HCLV株中分別擴增出大小為187和492 bp的特異性片段，對PRRSV、PCV2和TGEV等檢測結果均為陰性，對10份疑似豬瘟臨床樣品進行檢測后發現，有2份疑似CSFV強毒、7份疑似疫苗弱毒。李安等對GenBank中登錄的25株CSFV強毒株和HCLV株基因組全序列進行比較分析，設計1對豬瘟病毒強毒株和HCLV檢測通用引物，擴增片段為609 bp，并在該對引物擴增區域內設計針對疫苗弱毒的特異引物，擴增片段為237 bp，該法對牛病毒性腹瀉病毒和其他豬源病毒均不發生非特異反應，成功建立了一種能夠區分豬瘟病毒強毒和HCLV的敏感、特異、重復性好的RT-nPCR鑒別診斷方法。陳本龍等[4]根據Genbank上發表的豬瘟病毒全基因組序列，選擇豬瘟強毒株和兔化弱毒株疫苗株序列存在的差異區域，分別設計合成2條強毒株和HCLV株的特異性上游引物，同時選擇高保守區域序列，設計合成了一條強毒和兔化弱毒共用的下游引物，成功建立了一種能夠區分豬瘟病毒強毒株和HCLV的RT-PCR檢測方法。該法從豬瘟強毒株和兔化弱毒株中擴增出了大小分別為680 bp和785 bp的特異性片段，對PRRSV、BVDV、PRV、PCV2等病毒基因組擴增均為陰性，可檢測出最低為0.5 pg的豬瘟病毒RNA，具有高度的特異性和敏感性。

2??熒光定量RT-PCR方法

實時熒光定量PCR是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，它融匯了傳統PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點，為豬瘟病毒的定量檢測提供了新的分子生物學診斷技術。H.S.Cho等應用不同熒光基團標記的2條TaqMan MGB探針建立了能鑒別韓國CSFV野毒株和弱毒疫苗株的熒光RT-PCR方法，但此方法沒有做到定量檢測，而且也無法對我國的豬瘟病毒野毒株和HCLV株進行鑒別檢測。J.J.Zhao等根據GenBank中的豬瘟病毒強毒和弱毒株基因組序列，設計了1對針對豬瘟病毒的通用引物和2條分別針對豬瘟病毒強毒和HCLV的特異性TaqMan探針，建立了能區分豬瘟病毒強毒和HCLV株的復合實時熒光定量RT-PCR檢測方法。該方法能將我國大陸流行的不同基因亞群的豬瘟病毒強毒株與HCLV完全區分開來，而不與其他豬源病毒發生非特異反應。Lihong Liu等建立了疫苗株特異性和野毒株特異性的實時熒光RTPCR方法，其特異性強、敏感性高和重復性好。Leifer等建立了CSFV野毒株和HCLV的熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法，該法對豬瘟弱毒疫苗株具有良好的擴增效果，而對豬瘟野毒和其他瘟病毒均無擴增產物，具有良好的特異性與敏感性。劉俊等[5]針對CSFV野毒株和HCLV株的基因組特點設計了一條特異性探針，建立了豬瘟野毒株一步TaqMan-MGB RT-PCR診斷方法，該法能檢測5.3×102pgCSFV病毒核酸；能檢測除HCLV以外的豬瘟流行野毒株，對牛病毒性腹瀉病毒、細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒2型、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒等項檢測均為陰性；對122份疑似豬瘟樣本檢測的結果與RT-nPCR方法的符合率為94.3%（115/122），陽性和陰性符合率分別為86.4%（38/44）和98.7%（77/78）。謝金文等通過對GenBank中登錄的25株CSFV強毒株和HCLV株全基因組序列進行比較分析，設計一對共用下游引物以及分別針對CSFV強毒株與弱毒疫苗的特異性上游引物，建立的能鑒別CSFV強毒感染與弱毒疫苗的熒光定量RT-PCR方法，其Tm值分別為（84.5±0.5）℃和（88.5±0.5）℃，該法特異性強，對其他相關病毒無特異性擴增；敏感性高，最低檢出量為5×RID50的細胞疫苗基因組拷貝；重復性好；并且擴增效率高、線性范圍廣、檢測時間短，可對免疫豬群中CSFV強毒感染做出快速準確的鑒別檢測，為有效防制豬瘟提供依據。余以剛等設計了1對通用引物和2條特異性MGB探針，建立了豬瘟病毒野生株和疫苗株熒光RT-PCR鑒別方法，該法在選定的豬病相關病毒組內特異性符合率達100%；對野毒株和HCLV的檢測靈敏度分別達到1TCID50/mL和0.1TCID50/mL；組內和組間變異系數均在0.7%～2.2%之間。用該法對豬肉、脾臟和血液病料進行豬瘟野毒檢測的陽性率分別為66.7%、60.0%、77.8%，而傳統方法的陽性率分別為52.4%、40.0%、50.0%；檢出率比傳統方法要高。

3??RT-PCR與RFLP方法結合

限制性片段長度多態性分析(RFLP)是先將靶基因相關片段用PCR擴增，然后利用限制性內切酶能夠特異性地識別特定的堿基序列對擴增產物進行酶切，通過電泳可將酶切片段分離檢測，具有分辨率高、重復性好等優點，但操作比較復雜，對實驗條件要求高。趙耘等[6]建立了套式RT-PCR與RFLP相結合區分豬瘟強毒、疫苗弱毒的鑒別診斷RT-PCR/RFLP方法。該法對豬瘟病毒石門株與HCVL均能擴增出約為250 bp的特異性片段，而BVDV、BDV均未擴增出。RT-PCR純化產物被HgaI酶切后，弱毒能夠被酶切成大小分別約為150 bp、120 bp的2條片段，而強毒則不能被切開，可應用于CSFV野毒株和疫苗株的鑒別檢測。S.Vilcek等將CSFV基因組5′端非編碼區的選擇部分進行擴增，然后用選擇性限制內切酶Bbr PI對擴增的DNA片段進行切割，結果供試的13株CSFV疫苗株中的11株可被Bbr PI切割，切割位點在5′端非編碼區引物324/326旁的區域(CACGTG)，這11株疫苗株被切割電泳后均一致地出現2條特征性帶，分別長195 bp和89 bp，而23個歐洲田間野毒在5′端非編碼區無Bbr PI酶切位點，不能被此內切酶切割。董浩等[7]根據GenBank上已發表的HCV E2基因高度保守區設計一對特異性引物，從Shimen株和疫苗株中均能擴增出一條大小為750 bp的特異性片段，Shimen株的RT-PCR產物則被BglⅡ酶切為大小分別為520和230 bp的2條帶，疫苗株的RT-PCR產物不能被BglⅡ酶切，對病毒RNA的最小檢出量為3.96×10-4μg/m L，用該法可對豬瘟強毒株與HCLV株進行鑒別。胡繼明等建立了豬瘟病毒野毒株和HCLV的RT-PCR-RFLP鑒別檢測方法，對野毒株和HCLV進行RT-PCR擴增片段均能為825 bp片段，野毒株的PCR產物能被ApaⅠ酶切為322 bp和503 bp的2個片段，HCLV株則不能被酶切，檢測出RNA的最低濃度為2.86×10-2μg/m L。

4??環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增(LAMP)方法是日本學者Notomi等在2000年發明的一項恒溫核酸擴增新技術，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經濟等特點，特別適合在現場和基層部門應用。X.J.Zhang等建立了可視化檢測豬瘟病毒野毒株的LAMP方法，該法可檢測出2.5TCID50的CSFV石門株基因組RNA。對HCVL株、BVDV、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PPV、PCV2檢測結果均為陰性。通過對126份不同樣品進行檢測比較，該方法與實時熒光定量RT-PCR檢測方法的符合率達100%。隨后，又建立了檢測HCLV的LAMP方法，對CSFV 強毒株、BVDV、TGEV、PEDV、PRRSV、PPV、PRV、PCV2檢測結果均為陰性。張改平等[8]比較分析了CSFV標準強毒株、疫苗株、不同基因亞型的野毒株的全基因組序列差異，設計一套分別針對豬瘟強毒與弱毒NS5B基因的LAMP引物，建立特異性的豬瘟強毒株與疫苗株的LAMP檢測方法。該方法特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1 000倍，且重復性穩定性良好，為快速準確地鑒別CSFV野毒感染和疫苗接種提供了有效的方法。

5??小結與展望

近年來，豬瘟流行情況復雜，無規律可尋，豬瘟防控任務仍十分艱巨，由于豬瘟弱毒疫苗在我國的大規模應用，豬瘟的強毒、疫苗弱毒鑒別診斷成為豬瘟預防與控制中非常困難和棘手的問題。雖然豬瘟野毒與兔化弱毒分子生物學鑒別診斷方法有很多，但各有利弊，常規RT-PCR方法具有特異性強、敏感性高、檢出率高等特點，但不能準確地定量，容易污染，且敏感性有限，很難對處于亞臨床感染狀態的病豬進行早期診斷。熒光定量 RT-PCR技術彌補了常規RT-PCR方法的缺點，但由于需要價格昂貴的儀器與試劑，限制了其在基層獸醫部門的廣泛應用。LAMP方法檢測快速、簡便，適合在基層獸醫和養殖場進行推廣使用，對指導豬瘟的防控具有重要的意義，但LAMP方法靈敏度高易導致假陽性。隨著分子生物學的發展，相信一些新型診斷方法終將問世并得以推廣應用，使人們能夠快速、準確地鑒別診斷豬瘟野毒與兔化弱毒，從而盡早對豬瘟暴發做出準確快速的診斷，防止疫情蔓延；可以將CSFV野毒感染豬迅速從免疫豬群中篩查出來并予以清除，降低了在疫病暴發時弱毒疫苗免疫豬被淘汰的概率，為豬瘟的凈化和防控提供有效的方法。

[1] 丘惠深.凈化是有效控制我國豬瘟的重要手段[J].豬業科學，2010，27(3)：119.

[2] Li Y，Zhao J J，Li N，et al.A multiplex nested RT-PCR for the detection and differentiation of wildtype viruses from C-strain vaccine of classical swine fever virus[J].J Virol Methods，2007，143(1) ：16-22.

[3] 胡建和，杭柏林，王青，等.豬瘟強弱毒鑒別多重RT-PCR方法的建立及應用[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2008，36(11)：47-51.

[4] 陳本龍，張立懷，王建華，等.鑒別豬瘟病毒強毒和疫苗弱毒的RT-PCR檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2013，30（11）：71-74

[5] 劉俊，王琴，范學政，等.豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應用[J].中國農業科學，2009，42(12)：4366-4371.

[6] 趙耘，秦玉明，張廣川，等.RTPCR 和酶切方法區分豬瘟疫苗毒與野毒的研究［J］.微生物學通報，2006，33(3)：82-87.

[7] 董浩，李菲，王鑫，等.豬瘟病毒野毒株與疫苗株酶切檢測方法的建立、優化及應用[J].中國畜牧獸醫，2011，38（9）：187-189

[7] 張改平，何文博，王德國，等.豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測[J].鄭州大學學報：理學版，2014，46（3）：85-90.

2014-11-12）

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-06-011-14)

于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究。