MGMT基因甲基化水平與惡性膠質瘤細胞對烷化劑耐藥性的相關性

MGMT基因甲基化水平與惡性膠質瘤細胞對烷化劑耐藥性的相關性

楊潔袁江偉王玉祥宋玉芝李娟張辛楊瓊

(河北醫科大學第四醫院放療五病區，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討DNA修復蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)基因甲基化狀態與惡性膠質瘤細胞對烷化劑抗腫瘤藥物耐藥性的相關性。方法選擇36例經手術后病理學檢查確診的惡性膠質瘤患者作為研究組，選取同期腦卒中患者10例作為對照組，比較兩組患者術前、術后腦組織中的MGMT蛋白表達水平、MGMT甲基化狀態差異，并分析MGMT甲基化與治療效果的關系。結果研究組的MGMT蛋白表達陽性率顯著高于對照組，去甲基化水平顯著高于對照組(P<0.05)。有效組16例患者，無效組20例患者，有效組MGMT蛋白表達陽性率顯著低于無效組，甲基化水平顯著高于無效組(P<0.05)。Ⅲ級患者17例，Ⅳ級19例，兩種不同病理分級患者的MGMT蛋白、MGMT啟動子基因表達率上無差異(P>0.05)。MGMT蛋白表達陽性的20例患者中僅有3例甲基化表達(15%)，MGMT蛋白表達陰性的16例患者中有14例甲基化表達(87.5%)，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態具有關聯性(χ2=18.747，P=0.000)。結論MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態呈負相關性，MGMT基因去甲基化狀態會增加惡性膠質瘤細胞的耐藥性。

關鍵詞〔〕DNA修復蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶基因；甲基化狀態；惡性膠質瘤

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省衛生廳青年科技課題(No.20130245)

通訊作者：王玉祥(1969-),男，主任醫師，博士，主要從事惡性膠質瘤、食管癌、肺癌等的臨床與基礎研究。

第一作者：楊潔(1982-)，女，碩士，主要從事惡性膠質瘤的基礎及臨床研究。

烷化劑化療在腦膠質瘤的綜合治療中占有重要地位〔1〕。烷化劑主要通過攻擊人體細胞內的DNA，造成DNA堿基的烷基化損傷，進而形成DNA交聯，從而導致細胞死亡〔2〕。DNA修復蛋白6-O-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)作為一種細胞中普遍存在的DNA修復酶，是目前為止發現的唯一可以將6-O-鳥嘌呤復合物從DNA上移除的蛋白質，可以保護染色體免受烷化劑導致的突變、細胞毒以及致癌作用〔3〕。本研究探討MGMT基因甲基化狀態與惡性膠質瘤細胞對烷化劑抗腫瘤藥物耐藥性的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料本研究選取我院腫瘤科2009年1月至2012年8月收治的36例經手術后病理學檢查確診的惡性膠質瘤患者及同期腦卒中患者10例。納入標準：惡性膠質瘤患者均為首次入院治療、經過手術后組織學病理檢查確診的患者(WHO分級Ⅲ、Ⅳ級)、手術前未經過放療和化療治療、術前KPS評分>60分；腦卒中患者經過CT或MRI證實、并經過手術治療、不合并腫瘤。排除標準：合并身體其他部位腫瘤的患者，術前接受過放化療治療的患者。本研究共納入46例患者，研究組36例，男21例，女15例，年齡62～73〔平均(67.4±9.8)〕歲；對照組10例，男6例，女4例，年齡63～74〔平均(65.3±10.4)〕歲。兩組患者年齡、性別無差異(P>0.05)。

1.2治療方案患者均口服替莫唑胺(TMZ)，起始劑量為：每天150 mg/m2，共計5 d，停藥23 d，第1周期的治療時間為28 d。從第2周期開始，根據第1周期患者出現的不良反應適當調整劑量，最大可增至每天200 mg/m2，或者降至100 mg/m2。在放療過程中密切觀察患者狀態，若出現腦水腫等不良反應，應及時使用20%的甘露醇加激素等脫水、利尿、降顱壓。每周對患者進行血常規檢測，并定期復查肝腎功能，根據檢查的結果及時應用升血小板、白細胞或者保肝藥物。

1.3主要儀器與試劑PCR儀(美國PTC-100型PCR儀)；凝膠電泳(北京六一儀器廠)；SP廣譜試劑盒北京中山金橋生物公司；伊紅染液(臺灣BASO貝索企業)；DNA純化試劑盒(上海生工生物工程公司)；濃縮型鼠抗MGMT單克隆抗體(北京中山金橋生物公司)。

1.4免疫組化法測定腫瘤組織MGMT蛋白對患者的腫瘤組織進行HE染色后免疫組化，組織蠟塊以4 μm的厚度進行連續切片后，置于60℃的烤箱進行干燥40 min；常規脫蠟至水；在3%的過氧化氫溶液室中孵育10 min，以阻斷內源性過氧化氫的活性，滴加一抗，并在4℃的抗濕盒于冰箱中過夜；滴加聚合物增強劑，并在室溫下孵育20 min；滴加酶標抗鼠聚合物，室溫下孵育30 min；PBS(pH7.4)沖洗3 min，沖洗3次；將PBS去除，滴加剛配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。

1.5血清MGMT基因啟動子甲基化狀態測定首先制備患者外周血循環DNA并將其純化，具體純化方法參照羅敏捷的研究，并加以改進〔4〕。對患者的外周血循環DNA進行甲基化處理，并進行引物序列設計，對甲基特異性PCR進行擴增，應用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行擴增產物的鑒定。

1.6結果判定MGMT蛋白陽性染色主要定位于胞質及細胞核，染色為粉紅色。無任何染色(-)、著色極弱且難以判斷或陽性細胞≤10%者為(±)、有>10%且≤30%的著色陽性細胞(+)、有>30%的著色陽性細胞()。MGMT甲基化結果判定：MGMT-M(甲基化)或MGMT-U(非甲基化)如擴增出一條83 bp的帶者為陽性，MGMT-M陽性+MGMT-U陰性即為完全甲基化。MGMT-M陰性+MGMT-U陽性即為非甲基化。術后化療6個月療效判定：依據1979年世界衛生組織實體瘤療效評價標準，根據CT和MRI檢查結果：分為完全緩解(CR)：所有腫瘤病灶完全消失且持續4 w以上；部分緩解(PR):腫瘤病灶體積縮小≥50%；穩定(SD):腫瘤病灶體積增加<25%或縮小<50%；進展(PD): 腫瘤病灶體積增加≥25%或有新的腫瘤病灶出現。總有效例數=完全緩解+部分緩解。

1.7統計學方法采用SPSS10.0進行t及χ2檢驗。

2結果

2.1兩組MGMT表達及甲基化情況研究組的MGMT蛋白表達陽性率〔91.67%(33/36)〕顯著高于對照組〔10%(1/10)〕，去甲基化水平研究組〔94.44%(34/36)〕顯著高于對照組〔10%(1/10)，χ2=27.070,30.672,P<0.05〕。

2.2惡性膠質瘤患者化療6個月后不同療效患者的MGMT表達及甲基化情況有效組16例患者，無效組20例患者，有效組MGMT蛋白表達陽性率顯著低于無效組〔12.50%(2/16) vs 90%(18/20)〕，甲基化水平顯著高于無效組〔81.25%(13/16) vs 10%(2/20),χ2=21.623,18.566,P<0.05〕。

2.3不同病理分級患者的MGMT表達及甲基化情況Ⅲ級患者17例，Ⅳ級19例，Ⅲ級與Ⅳ級患者的MGMT蛋白陽性率、MGMT啟動子基因甲基化〔35.29%(6/17) vs 47.37%(9/19),χ2=0.071,P=0.530〕差異均不具有統計學意義(P>0.05)。

2.4MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化的相關性MGMT蛋白表達陽性的20例患者中僅有3例甲基化表達(15%)，MGMT蛋白表達陰性的16例患者中有14例甲基化表達(87.5%)，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態具有關聯性(χ2=18.747，P=0.000<0.001)。

我們應注意到季札是將《唐風》和堯聯系起來考慮的。 他說：“思深哉！其有陶唐氏之遺民乎？不然，何憂之遠也？非令德之后，誰能若是？”也就是說，晉國處于堯之故地，故有堯之遺風。 若其不是故堯之遺民，則不會如此憂思之遠，不會有如此之深慮。 這又不得不對堯文化進行考察。

3討論

烷化劑藥物殺傷腫瘤細胞的機制現已經非常明確，主要通過攻擊人體細胞內的DNA，造成DNA堿基的烷基化損傷，進而形成DNA交聯，從而導致細胞死亡。MGMT為一種全長為769 bp的cDNA，可以保護染色體免受烷化劑導致的突變、細胞毒以及致癌作用。在腫瘤細胞中，MGMT分子上的2個烷基受體可以接受烷基化損傷的DNA烷基，從而修復被烷基化損傷的鳥嘌呤，阻止DNA的交聯以降低烷化劑藥物的細胞毒性作用〔5〕。但值得注意的是，MGMT只能夠修復被烷化劑藥物損傷的烷基化鳥嘌呤，但對已經交聯的DNA卻沒有作用〔6〕。

腦膠質瘤具有多種不同的病理類型，而MGMT對其化療效果的影響也不同。對于多形性膠質母細胞瘤，卡莫司汀對于MGMT陽性的病人比MGMT陰性的病人化療效果差。但對于間變性星型細胞瘤，化療效果與MGMT表達關系并不密切〔7〕。MGMT基因啟動子甲基化的發生率就越低，腫瘤的惡性程度就越高〔8〕。在治療方面，在化療基礎上加用TMZ進行治療可以明顯改善惡性膠質瘤患者的生存率(2年生存率為46%)，從而建立了一種惡性膠質瘤新的治療標準〔9〕。MGMT基因作為一種可以識別惡性膠質瘤的臨床相關性分子標記物，其基因沉默與TMZ的治療效果具有相關性〔10〕。在與腫瘤細胞耐藥性的關系研究方面，MGMT酶蛋白、酶活性以及MGMT mRNA的高低決定了腫瘤細胞對烷化劑的耐藥程度，即MGMT活性越高的細胞對烷化劑的耐藥性就越強，因此，如果能夠降低腫瘤細胞內的MGMT蛋白水平或者酶活性就很有可能克服腫瘤細胞對于烷化劑的耐藥性。

腫瘤組織中的MGMT基因啟動因子與其血清中的含量具有顯著一致性，在檢測膠質母細胞瘤以及非小細胞型肺癌患者的腫瘤組織以及血清中的MGMT基因甲基化水平可以發現，血清中的MGMT基因啟動因子甲基化與腫瘤組織具有顯著的相關性〔6〕。因此，通過檢測膠質瘤患者血清中的MGMT基因啟動因子甲基化可以用于制定個體化的化療方案以及預測患者的預后。而本研究結果與上述研究結果相似，說明膠質瘤患者血清中的MGMT蛋白表達高于其他非腫瘤性疾病，可以用于輔助臨床診斷。本研究顯示MGMT蛋白可以在不同類型膠質瘤的表達上有差異，但在不同分期膠質瘤的區分上還不夠靈敏，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態具有關聯性。

綜上，MGMT蛋白表達與MGMT啟動子基因甲基化狀態呈負相關性，但與病理分型無關，MGMT基因去甲基化狀態會增加惡性膠質瘤細胞的耐藥性，因此對于沒有通過手術獲得病理診斷的患者，測定其血清MGMT蛋白與MGMT啟動子基因甲基化情況可以指導臨床進行個性化化療方案的選擇。

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〔2013-10-15修回〕

(編輯曹夢園)