TFAM在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的作用

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·綜述·

TFAM在卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的作用

谷海唐莉1

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500)

〔關(guān)鍵詞〕線粒體；線粒體DNA；TFAM；卵母細胞；胚胎

1云南省第一人民醫(yī)院生殖遺傳一科

第一作者：谷海(1988-)，男，碩士，主要從事不孕不育臨床醫(yī)學(xué)研究。

線粒體在生殖細胞的發(fā)育和功能發(fā)揮著重要的作用。線粒體含有一組母系遺傳基因，在生殖細胞發(fā)育過程中應(yīng)將未受活性氧損傷的線粒體遺傳給后代。核基因編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是線粒體轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要調(diào)控因子，調(diào)控線粒體DNA的拷貝，影響卵母細胞和胚胎的發(fā)育。本文主要從TFAM對卵母細胞、胚胎影響的角度進行了綜述。

1TFAM的生物學(xué)特性

線粒體基因與其產(chǎn)物在卵母細胞的形成和發(fā)育中扮演著重要角色〔1，2〕，具有多效性功能的TFAM能夠調(diào)節(jié)動物成熟卵母細胞中線粒體(mtDNA)的拷貝數(shù)。線粒體具有獨立于核的基因，但其轉(zhuǎn)錄和翻譯必須依賴核基因編碼的各種蛋白因子的調(diào)控〔3〕。TFAM是一種核基因編碼的DNA結(jié)合蛋白，同時也參與線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的過程〔4〕，它能夠定點結(jié)合到mtDNA重鏈和輕鏈上激活mtDNA的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)mtDNA的復(fù)制。TFAM首先由TFAM基因在胞質(zhì)內(nèi)形成246個氨基酸組成約25 kD的前體，在線粒體靶向序列的轉(zhuǎn)運下進入線粒體后，靶向序列被切除，形成約21 kD的成熟TFAM蛋白，成熟TFAM蛋白具有兩個高遷移率族蛋白(HMG)結(jié)構(gòu)域，HMG能夠非特異性結(jié)合mtDNA〔5〕。研究顯示，mtDNA與TFAM的結(jié)合率非常高，推測mtDNA表面可能被TFAM完全覆蓋〔6〕。猜測TFAM可能有組蛋白的作用，維持mtDNA的穩(wěn)定和拷貝數(shù)，并形成調(diào)節(jié)作用。TFAM是生殖細胞中穩(wěn)定mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)鍵調(diào)控因子，盡管TFAM的轉(zhuǎn)錄翻譯機制尚不明確，但最近研究確定TFAM的翻譯后功能水平的調(diào)控因子。

Matsushima等〔7〕發(fā)現(xiàn)在果蠅細胞核內(nèi)敲除Lon后，TFAM和mtDNA含量的顯著性增加，顯示Lon蛋白酶降低TFAM的表達，說明TFAM的表達受Lon蛋白酶的影響。盡管Lon蛋白酶介導(dǎo)的TFAM下調(diào)的觸發(fā)機制尚不清楚，但最近研究顯示人類細胞TFAM的HMG結(jié)構(gòu)域能夠被cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)磷酸化，磷酸化的HMG降低了TFAM與mtDNA的結(jié)合能力，導(dǎo)致TFAM從DNA上解離影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄〔8〕。有人提出假說：TFAM通過完全錨定到DNA鏈上發(fā)揮修復(fù)作用〔9〕。TFAM蛋白在DNA上的滑行促使DNA的解鏈，很多實驗證實TFAM能夠維護mtDNA的穩(wěn)定和拷貝數(shù)〔7，10〕。

研究〔11〕顯示具有特異性結(jié)合mtDNA的TFAM結(jié)構(gòu)域圍繞于mtDNA D-loop環(huán)起始位點，參與線粒體的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。而非特異性結(jié)合mtDNA的結(jié)構(gòu)域包裝線粒體，同時維持和調(diào)節(jié)線粒體的拷貝數(shù)。增強子附近的TFAM特異性結(jié)合序列調(diào)節(jié)線粒體的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。

2TFAM與卵母細胞成熟

卵母細胞成熟分為細胞核和細胞質(zhì)成熟。目前核成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要以核膜崩解、同源染色體分離、第一極體排到卵周間隙為標(biāo)準(zhǔn)，但細胞質(zhì)的成熟比較復(fù)雜，且一直缺乏有效的觀察和評價指標(biāo)，但有研究認為胞質(zhì)成熟的標(biāo)志是卵母細胞完成mRNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白的復(fù)制和某些細胞器的再分布(包括線粒體)〔12〕。

卵母細胞成熟過程中最明顯的變化是線粒體數(shù)目急劇增多，從最初的不足10個，到成熟后200 000～500 000個，遠遠多于其他細胞。在人類成熟卵母細胞中，mtDNA拷貝數(shù)超過200 000，較原始生殖細胞(約200拷貝數(shù))顯著增加，因此卵胞漿內(nèi)足夠的線粒體、mtDNA拷貝數(shù)是卵母細胞成熟所必需的。Mahrous等〔13〕用PI3K抑制劑抑制卵母細胞體積的增長，在第7天測mtDNA拷貝數(shù)，其含量與對照組沒顯著性差異，實驗體現(xiàn)出mtDNA在卵母細胞成熟過程中的重要性，也暗示了線粒體數(shù)目及mtDNA含量的不足將嚴重影響卵母細胞成熟程度及后續(xù)的胚胎發(fā)育質(zhì)量。而TFAM的含量與mtDNA拷貝數(shù)密切相關(guān)〔14〕，TFAM對線粒體的合成以及卵母細胞成熟、胚胎發(fā)育是必不可少的〔1〕，因此TFAM的表達水平可以成為卵母細胞發(fā)育潛能和后期胚胎發(fā)育能力的指標(biāo)。

卵母細胞成熟要經(jīng)歷減數(shù)分裂阻滯期，成熟促進因子(MPF)活性是克服阻滯的關(guān)鍵，MPF包括WeelB和CDK1兩個亞基，CDK1在哺乳動物卵母細胞分裂重啟中有著不可替代的作用。蛋白激酶A(PKA)通過磷酸化WeelB 15位絲氨酸抑制MPF的活性，進而抑制阻滯期重啟。PKA也能將TFAM的HMG結(jié)構(gòu)域磷酸化，而降低了TFAM結(jié)合mtDNA的能力，影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使卵母細胞中物質(zhì)得不到儲存，從另一方面抑制了卵母細胞阻滯的重啟〔12〕。

卵母細胞胞質(zhì)成熟的能力，也就是減數(shù)分裂的能力，和卵泡的大小有一定的關(guān)聯(lián)。相對于直徑為2～6 mm的卵泡，大于6 mm的卵泡有更好的囊胚發(fā)育率，線粒體數(shù)量也較多〔15〕，較好發(fā)育潛能的卵母細胞有更高的線粒體活性〔16〕。在卵母細胞發(fā)育過程中，大量線粒體的累積〔2〕，顯示線粒體數(shù)量對早期胚胎發(fā)育的重要性〔17〕。Machatkova等〔18〕在牛卵母細胞研究中發(fā)現(xiàn)，來自較大卵泡的卵母細胞，比來自較小卵泡的卵母細胞線粒體有更高的活性，但卵母細胞成熟后，這種活性差異消失。檢測線粒體相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，來自GV期較小卵泡的卵母細胞有較高的TFAM mRNA水平，但到了MⅡ期，其mRNA水平?jīng)]有明顯差異?？赡苁且驗閬碜暂^小卵泡的GV期卵母細胞，mtDNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯尚未完成，需要更高的TFAM mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。

有較高減速分裂潛能的卵母細胞，有高活性和重組的線粒體。而相對于減速分裂高潛能的卵母細胞，低潛能的卵母細胞有更豐富的TFAM基因mRNA，但是其線粒體重組和ATP的生成能力都較低。

3TFAM與早期胚胎發(fā)育

在大多數(shù)生物中，mtDNA都是母性遺傳，這種遺傳方式可以解釋為配子大小不同，精子遠比卵母細胞小的多，mtDNA含量也不盡相同，卵母細胞含有105～108拷貝數(shù)，而精子僅僅含有100個拷貝〔19〕。有研究表明，在人類精子形成過程中，mtDNA含量低下與TFAM因子降低有關(guān)〔5〕，胚胎mtDNA含量同樣受到TFAM的調(diào)控。在小鼠mtDNA的拷貝數(shù)以及胚胎形成上，TFAM也發(fā)揮著重要作用。TFAM+/-小鼠的mtDNA、TFAM mRNA及其產(chǎn)物都顯著性減少，并影響呼吸鏈的完整性，TFAM-/-小鼠可在胚胎發(fā)育的8.5～10.5 d可導(dǎo)致胚胎死亡〔5〕。但并不是TFAM含量越高越好，低水平TFAM不影響mtDNA復(fù)制，而高水平則與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，可以得出TFAM對mtDNA的調(diào)節(jié)是動態(tài)的〔20〕。mtDNA缺失的Hela細胞，其TFAM基因mRNA顯著性升高〔21〕，體細胞部分去除線粒體后體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，TFAM 的表達上調(diào)，并能夠彌補mtDNA含量的缺失〔22〕，將小鼠心肌細胞TFAM基因敲除后，小鼠表現(xiàn)出心肌炎和呼吸鏈缺陷癥狀〔23〕，這些結(jié)果表明，TFAM基因在維持mtDNA含量及其轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的重要性，和在維持氧化磷酸化正常功能中的重要地位。

作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的重要調(diào)節(jié)子，TFAM對于mtDNA的維護及在胚胎形成上發(fā)揮至關(guān)重要的作用〔5〕。在早期胚胎發(fā)育過程中，TFAM的轉(zhuǎn)錄隨mtDNA含量增加而增加〔24〕。Chiaratti等〔25〕在去除30%以上線粒體的牛卵母細胞研究中發(fā)現(xiàn)，對照組(CO)中，胚胎在發(fā)育的第3天到第6天，線粒體數(shù)量明顯增加，6 d以后基本沒變，但線粒體去除組(DE)線粒體數(shù)量第3天到第6天明顯增加，6 d以后持續(xù)增加。而TFAM的轉(zhuǎn)錄也呈相應(yīng)的變化，CO組和DE 組TFAM在胚胎發(fā)育的第3天到第6天都顯著性增加，但CO組在第6天以后保持不變，而DE組在第9天后仍在增加。在DE組TFAM的表達持續(xù)性增加，他們猜測可能是胚胎延長核基因組編碼參與線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄基因表達的窗口，為胚胎后期分裂補充mtDNA含量。華松等〔26〕在胚胎異質(zhì)性線粒體研究中發(fā)現(xiàn)，8-細胞期以后，含有異質(zhì)性線粒體的胚胎中TFAM mRNA的水平較正常組顯著性增加，其甲基化水平相對于正常組顯著降低，其囊胚率也顯著低于對照組。如果早期胚胎發(fā)育受阻，其線粒體數(shù)量和單個線粒體內(nèi)mtDNA數(shù)量增加，線粒體調(diào)控因子上調(diào)〔27〕，異質(zhì)性線粒體胚胎中TFAM甲基化水平降低，隨著胚胎發(fā)育這種現(xiàn)象越來越明顯〔28〕，說明異質(zhì)性線粒體能夠影響主要基因的重編程，進而調(diào)控mtDNA數(shù)量，也從另一個角度闡述了TFAM對胚胎發(fā)育的重要性。

4小結(jié)

TFAM在線粒體調(diào)控和線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、功能的維持和結(jié)構(gòu)的修復(fù)過程中有著重要的作用〔5〕，而線粒體在卵母細胞及胚胎發(fā)育中的作用至關(guān)重要〔2，19〕，mtDNA在代代之間遺傳的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出健康線粒體及mtDNA含量的重要性〔28〕。卵母細胞中每個線粒體只有一個mtDNA拷貝，TFAM的缺失可導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)的減少和嚴重的呼吸鏈缺陷，繼而影響生殖細胞的發(fā)育。在生殖細胞中TFAM的研究還少見，以后或許會成為研究焦點，為進一步促進輔助臨床生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供實驗依據(jù)。

5參考文獻

1Amikura R，Sato K，Kobayashi S.Role of mitochondrial ribosome-dependent translation in germline formation in Drosophila embryos〔J〕.Mech Dev,2005;122(10)：1087-93.

2Ge H，Tollner TL，Hu Z，etal.The importance of mitochondrial metabolic activity and mitochondrial DNA replication during oocyte maturation in vitro on oocyte quality and swbseqwent embryo developmental competence〔J〕.Mol Reprod Dev,2012;79(6):392-401.

3劉珊珊，李鈺.哺乳動物細胞線粒體基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控〔J〕.細胞生物學(xué)雜志，2009;31(6)：811-6.

4Falkenberg M，Larsson NG，Gustafsson CM.DNA replication and transcription in mammalian mitochondria〔J〕.Annu Rev Biochem,2007;76(6)：679-99.

5Rantanen A，Jansson M，Oldfors A，etal.Down regulation of TFAM and mtDNA copy number during mammalian spermatogenesis〔J〕.Mamm Genome,2001;12(10)：787-92.

6Alam TI，Kanki T，Muta T，etal.Human mitochondrial DNA is packaged with TFAM〔J〕.Nucleic Acids Res,2003;31(6)：1640-5.

7Matsushima Y，Goto Y，Kaguni LS.Mitochondrial Lon protease regulates mitochondrial DNA copy number and transcription by selective degradation of mitochondrial transcription factor A(TFAM)〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010；107：18410-25.

8Lu B，Lee J，Nie XB，etal.Phosphorylation of human TFAM in mitochondria impairs DNA binding and promotes degradation by the AAA+ Lon protease〔J〕.Mol Cell,2013;49(1)：121-32.

9Canugovi C，Maynard S，Bayne AC，etal.The Mitochondrial transcription factor A functions in mitochondrial base excision repair〔J〕.DNA Reapir,2010;9(10)：1080-9.

10Farge G，Laurens N，Broekmans OD，etal.Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A〔J〕.Nat Commun,2012;3(9)：1013.

11Kasashima K，Nagao Y，Endo H，etal.Dynamic regulation of mitochondrial genome maintenance in germ cells〔J〕.Reprod Med Biol,2014;13(1)：11-20.

12Ferreira EM，Vireque AA，Adona PR，etal.Cytoplasmic maturation of bovine oocytes：structural and biochemical modifications and acquisition of developmental competence〔J〕.Theriogenology,2009;71(5)：836-48.

13Mahrous E，Yang Q，Clarke HJ，etal.Regulation of mitochondrial DNA accumulation during oocyte growth and meiotic maturation in the mouse〔J〕.Reproduction,2012;144(2)：177-85.

14Ekstrand MI，F(xiàn)alkenberg M，Rantanen A，etal.Mitochondrial transcription factor A regulates mtDNA copy number in mammals〔J〕.Hum Mol Genet,2004;13(8);935-44.

15Armstrong DT.Effects of maternal age on oocyte developmental competence〔J〕.Theriogenology，2001;55(6)：1303-22.

16Egerszegi I，Alm H，Ratky J，etal.Meiotic progression，mitochondrial features and fertilisation characteristics of porcine oocytes with different GAPDH activities〔J〕.Reprod Fertil,2010;22(5)：830-8.

17May-Panloup P，Chretien MF，Malthiery Y，etal.Mitochondrial DNA in the oocyte and the developing embryo〔J〕.Curr Top Dev Biol,2007;77(1)：51-83.

18Machatkova M，Jeseta M，Hulinska P，etal.Characteristics of bovine oocytes with different meiotic competence in terms of their mitochondrial status and expression of nuclear-encoded factors〔J〕.Reprod Dom Anim,2012;47(5)：806-14.

19Wai T，Ao A，Zhang X，etal.The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility〔J〕.Biol Reprod,2010;83(1)：52-62.

20Campbell CT，Kolesar JE，Kaufman BA.Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation，DNA packaging，and genome copy number〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1819(9-10)：921-9.

21Miranda S，F(xiàn)oncer R，Guerrero J，etal.Oxidative stress and upregulation of mitochondrial biogenesis in mitochondrial DNA-depleted HeLa cells〔J〕.Biochen Biophys Res Commun，1999;258(1)：44-9.

22Seidel-Rogol BL，Shadel GS.Modulation of mitochondrial transcription in response to mtDNA depletion and repletion in HeLa cells〔J〕.Nucleic Acids Res,2002;30(9)：1929-34.

23Wang J，Wilhelmsson H，Graff C，etal.Dilated cardiomyopathy and atrioventricular conduction blocks induced by heart-specific inactivation of mitochondrial DNA gene expression〔J〕.Nat Genet,1999;21(1)：133-7.

24May-Panloup P，Vignon X，Chretien MF，etal.Increase of mitochondrial DNA content and transcripts in early bovine embryogenesis associated with upregulation of mtTFA and NRF1 transcription factors〔J〕.Reprod Biol Endocrinol,2005;3(1)：65.

25Chiaratti MR，Bressan FF，F(xiàn)erreira CR，etal.Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle〔J〕.Biol Reprod，2010;82(1)：76-85.

26華松，張涌.異質(zhì)性線粒體對牛孤雌激活胚胎早期發(fā)育的影響〔EB/OL〕.中國科技論文在線,http://www.Paper Edu.cn,2010-11-23.

27Facucho-Oliveira JM，St John JC.The relationship between pluripotency and mitochondrial DNA proliferation during early embryo development and embryonic stem cell differentiation〔J〕.Stem Cell Rev Report，2009;5(1)：140-58.

28Kogo N，Tazaki A，Kashino Y.etal.Germ-line mitochondria exhibit suppressed respiratory activity to support their accurate transmission to the next generation〔J〕.Dev Biol,2011;349(2)：462-9.

〔2015-02-11修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：唐莉(1971-)，女，博士，副教授，主要從事不孕不育臨床醫(yī)學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81260510)

〔中圖分類號〕Q132.8

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6593-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.136