寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的研究進展與應用前景

王 釗，王 好，錢愛東，劉艷輝，祖岫杰，周井祥?

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118；2.吉林省水產科學研究院，長春130033）

寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的研究進展與應用前景

王 釗1，王 好1，錢愛東1，劉艷輝2，祖岫杰2，周井祥1?

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118；2.吉林省水產科學研究院，長春130033）

就寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的一些生理生化與免疫學性質進行了概括，闡述了該酶與宿主免疫應答之間的作用關系，證明了該酶具有作為研制高效核酸疫苗的條件，同時綜述了寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的發展以及應用前景。

寄生蟲；半胱氨酸蛋白酶；核酸疫苗

寄生蟲引起的疾病直接或間接影響著人類的健康與經濟發展，人們迫切需要新穎高效的方法來防治寄生蟲，但是寄生蟲無論是從大小上，還是從生化成分或入侵模式上來講都與細菌或病毒存在著很大區別。寄生蟲的生活史復雜、表面抗原多樣且易變、多數擁有背膜與殼片等諸多性質往往誘發宿主復雜的免疫反應，而且大多數寄生蟲的靶寄生位點是宿主的免疫豁免區［1］，因此普通藥物和疫苗很難殺滅蟲體，這導致目前對寄生蟲的防治捉襟見肘。由于核酸疫苗可避免常規藥物與傳統疫苗的治療缺陷，一方面具有高效、高特異性、通用性強、綠色環保、成本低等優點，另一方面在寄生蟲治療領域罕有應用，因此成為了抗寄生蟲治療的研究熱點［2］。寄生蟲抗原按生化成分通常分為蛋白質、糖蛋白、多糖、核酸和類脂等，目前傳統疫苗與核酸疫苗多應用結構蛋白作為基礎，但對于寄生蟲來說結構蛋白的抗原性具有種、屬、株的特異性，即便是同一株也具有期的特異性［3］，免疫學性質不穩定，因此并不具備研制高效通用疫苗的條件。最近的研究發現一些膜內分泌蛋白，尤其是酶類，不僅具有很強的抗原性，而且在同一蟲體的不同發育時期均有分泌，參與蟲體的入侵、吸附、繁殖、免疫逃避等過程，并在寄生蟲與宿主之間的相互作用中扮演重要角色［4］。半胱氨酸蛋白酶是一種廣泛存在于寄生蟲的分泌蛋白，在寄主體內寄生蟲產生的半胱氨酸蛋白酶參與蟲體整個生活史，影響宿主Th細胞的分化，調節Th1與Th2應答，干預寄主Th1／Th2應答平衡來達到寄生目的［5］。 早在 1995年，Jankovic等［6］就發現曼氏血吸蟲分泌的一種鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶的一個亞基sm－p80可誘導Th1型免疫應答因其具有免疫原性，并已經作為研制疫苗的候選抗原。Schnapp等［7］在2002年發現克氏錐蟲的一種叫Cruzipain的L樣半胱氨酸蛋白酶可以誘導鼠脾臟細胞Th2細胞因子的產生，主張將這種酶作為預防克氏錐蟲感染的候選疫苗保護性抗原。2003年Pollock等［8］發現墨西哥利士曼原蟲的半胱氨酸蛋白酶CPB基因是致病力的關鍵基因。Cameron等［9］在2004年發現由墨西哥利士曼原蟲產生的半胱氨酸蛋白酶可作為一種調節因子對小鼠骨髓巨噬細胞信號通路NF－κB進行調控使其失活從而降低IL－12細胞因子的釋放。Swenerton等［10］在2010年發現利士曼原蟲的半胱氨酸蛋白酶寡肽B是參與蟲體免疫逃避的重要因素。這些學者的研究成果豐富了寄生蟲半胱氨酸蛋白酶與宿主免疫應答的作用關系，在一定程度上證明了寄生蟲半胱氨酸蛋白酶具有作為抗原來研制疫苗的潛力。雖然國內外有一些寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的相關研究，但半胱氨酸蛋白酶作為一種新的抗原用于研制核酸疫苗仍具有很多技術空白，因此抗寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗將具有很大的研究余地與良好的應用前景。

1 半胱氨酸蛋白酶

1.1 蛋白酶 蛋白酶是具有生物活性的大分子物質，是各種寄生蟲的重要組成成分。蛋白酶可以大致分為外肽酶和內肽酶兩組。前者具有選擇性裂解羧基末端和氨基末端的能力，后者則專門裂解多肽的內鏈。蛋白酶還可以根據其催化活性位點的化學組成成分進一步細分為五種類型：半胱氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和金屬蛋白酶。這些不同的催化活性位點在蛋白質裂解的過程中起到重要作用。

1.2 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶分為CA、CD兩大主族，這兩大族仍可細分為不同的家族，很多重要的寄生蟲蛋白酶屬于CA主族下的C1、C2家族，且全都為分泌型或胞內作用型。屬于C1家族的酶可以細分為三個亞族：博來霉素水解酶、L樣組織蛋白酶、B樣組織蛋白酶。擁有鈣結合域的鈣蛋白酶則屬于C2家族。存在于溶酶體狀隔間中的豆莢樣蛋白酶屬于CD主族［11］。

編碼寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的基因廣泛存在于各種寄生蟲中，在寄生蟲的生活史中是極為重要的物質［12］。比如蟲體對營養的攝取，在宿主體內的移行，生殖發育，參與逃避宿主的免疫監視，對細胞的浸潤與毒力，脫包囊，蟲卵的孵化與蛻皮等過程均與該酶有重要關系［13］。其中最主要的功能之一是通過影響Th1或Th2型應答來調節宿主的免疫應答從而使宿主無法有效驅逐入侵機體的寄生蟲，從而達到免疫逃避的目的。因此該酶將決定寄生蟲能否長期寄生于宿主體內。

1.3 寄生蟲半胱氨酸蛋白酶的免疫原性與免疫逃避機制 寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶對于宿主來說是一種具有很強免疫原性的異己物質。成熟的肝片吸蟲擁有兩種半胱氨酸蛋白酶 Fas1、Fas2，通過免疫分析發現這兩種酶是免疫優勢抗原具有較高的敏感性與特異性。大片吸蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶具有很強的免疫原性，是抗寄生蟲感染的潛在保護性抗原［14］。曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴的半胱氨酸蛋白酶能夠引起宿主特異性IgE抗體反應。屋塵螨排泄物中的Der p1（半胱氨酸蛋白酶家族）是一種常見的過敏原。有報道稱在感染了血吸蟲的成年人腸道中得到的兩種半胱氨酸蛋白酶與其他哺乳動物宿主血清發生了特異性抗體反應。以上實例說明了半胱氨酸蛋白酶具有一定的免疫原性，可用于疫苗的構建與診斷。

肝片吸蟲分泌的一種被命名為FgCatL1H的L樣組織蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶家族）能有效作用于宿主的I型膠原蛋白、層粘連蛋白、以及免疫球蛋白IgG等底物，該酶可水解粘連蛋白，并將宿主的免疫球蛋白裂解為Fab與Fc片段，因此降低了宿主嗜酸性粒細胞的粘附能力與巨噬細胞對寄生蟲的免疫作用［15］。另外該蟲利用誘導后的半胱氨酸蛋白酶對細胞表面CD4進行切割，使得肝片吸蟲用抑制了淋巴細胞的增殖，抑制了宿主的Th1型反應，實現免疫逃避。溶組織阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶的高效底物是IgA與IgG抗體［16］，是該蟲免疫逃避機制中最重要的因素。同樣，肥頭絳蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以降解宿主的IgG抗體。一些寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶也可以誘導白介素4參與抑制宿主的Th1型免疫應答，降低了宿主對寄生蟲的免疫能力。以上表明寄生蟲蛋白酶具有降解抗體和調節細胞免疫應答的功能，進而通過這種機制阻止宿主對寄生蟲的免疫反應。有報道稱半胱氨酸蛋白酶還可協助蟲體進行新陳代謝、生長發育、組織皮層的更新等，以此確?？乖牟粩嘧兓瘞椭x體逃避宿主的免疫監視［17］。由于半胱氨酸蛋白酶擁有以上性質，因此使寄生蟲獲得免疫逃避能力。由于重組半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗不僅可誘導機體產生Th1型細胞免疫應答，還可以刺激機體的體液免疫應答，持續產生特異性抗體，與半胱氨酸蛋白酶形成緊密復合物，封閉了酶的活性中心而影響其本身的催化活性來抑制該酶的作用?；诤怂嵋呙绲倪@種特性，人們便可實現對寄生蟲感染的有效防護。

2 一些寄生蟲半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗研究進展

對寄生蟲半胱氨酸蛋白酶研究的深入揭示出該酶對于免疫防治具有重要價值。無論是從生物學特性還是從化學性質上來看，半胱氨酸蛋白酶都具備作為化學治療靶物質的特點，通過抑制該酶的活性便可以達到阻斷寄生蟲入侵、繁殖、營養等諸多重要生理環節。采用核酸疫苗使宿主能夠產生針對該酶的特異性抗體進而實現對寄生蟲的防治是一種新穎而巧妙的方法，目前已經有相關基因與蛋白酶的研究，但多數停留在試驗階段，有待于進一步發展。

2.1 變形蟲 變形蟲可引起人類腸炎與腹瀉，使易感性小鼠與抗性小鼠分別產生Th2與Th1型免疫反應。何光志等人使用半胱氨酸蛋白酶基因（EhCP112）制成抗溶組織阿米巴重組疫苗接種仔豬后，發現對宿主產生了顯著的保護性［18］。這種半胱氨酸蛋白酶是溶組織阿米巴感染細胞和造成組織損傷時的重要物質。雖然接種核酸疫苗后的宿主并沒有產生顯著的抗體反應，但卻使宿主得到了很強的免疫保護，這表明在寄生蟲感染時細胞免疫具有很重要的地位。因此針對細胞免疫設計特異性表達的核酸疫苗來治療感染將會事半功倍。

2.2 鞭毛蟲 半胱氨酸蛋白酶基因（CPA和CPB）制成的抗利士曼原蟲重組蛋白與重組質粒在BALB／c小鼠體內進行了實驗，結果發現可以給予宿主部分保護能力，并使 Th2型應答轉變為 Th1型應答［19］。但是CPA和CPB基因單獨接種并不能產生保護力，只有聯合接種才能產生效果［20］。應用墨西哥利士曼原蟲的CPB基因、金屬蛋白酶基因（GP63）、同源蛋白激酶C受體基因（LACK）和亞馬遜屬膜糖蛋白基因（GP64）制成一種復合核酸疫苗，也獲得與上述相似的結果［21］。鮭隱鞭蟲金屬蛋白酶與半胱氨酸蛋白酶重組核酸疫苗接種鮭魚后，發現前者增強了鮭魚的保護力，而后者則誘發宿主的易感性［22］。這說明半胱氨酸蛋白酶對于宿主的免疫影響具有多物質協同性，如果抑制其中任何相關元素都可能導致寄生蟲毒力的減弱甚至消失。因此構建核酸疫苗的同時需要考慮相關協同物質的表達。

2.3 吸蟲 小鼠接種了肝片吸蟲L樣半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗后，體內蟲卵的數量明顯減少。斯普拉－道來氏大鼠接種了華支睪吸蟲半胱氨酸蛋白酶（CsCp）核酸疫苗后呈現出顯著的保護性［23］。小鼠感染曼氏血吸蟲45 d后接種該蟲天冬酰胺轉肽酶（SM32）核酸疫苗，并沒有明顯降低宿主體內的蟲體數量，但是卻發現可以降低蟲體的繁殖能力，其中鈣蛋白酶大亞基sm－p80蛋白疫苗為小鼠提供了39%的保護力，配合佐劑使用后保護力提升到44%并使宿主體內蟲卵含量降低了29%～39%。最近研究表明編碼sm－p80基因的重組核酸疫苗能降低宿主體內59%的蟲體含量和84%的蟲卵含量［24］。這些結果揭示了不同類型的半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗對宿主均能產生一定的保護性，然而高效的核酸疫苗仍然需要佐劑的配合，篩選更具有保護性的基因與佐劑將成為熱點。

2.4 粘孢子蟲 碘泡蟲屬的腦粘體蟲分泌一種具有很強免疫原性的半胱氨酸蛋白酶，基因（MyxCP－1）誘導蟲體表達一種Z樣組織半胱氨酸蛋白酶，該酶可引起魚類患婆娑病。通過實時熒光定量PCR檢測發現在感染魚的體內各種組織均有該酶的表達，并通過免疫學分析發現阻止該酶的表達可以緩解病程［25］，這為魚類抗粘孢子蟲核酸疫苗的研制提供實驗基礎。

綜上所述，前人實驗結果均充分表明了半胱氨酸蛋白酶是寄生蟲寄生機制的重要組成成份，也是其毒力的主要影響因素。由于該酶對宿主的毒性常具有多物質協同性，通過人工方法干擾該酶的活性或抑制相關物質的分泌都可以影響寄生蟲的生存，因此構建經過優化的核酸疫苗通過主動免疫宿主調節其Th免疫應答類型，使宿主獲得較強的保護性，證明了半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗應用的可行性。

3 展望

近來，對寄生蟲半胱氨酸蛋白酶結構和功能的研究已基本清楚，作為抗寄生蟲感染防治中的新物質具有很充分的科學依據和實驗背景。進一步分析寄生蟲半胱氨酸蛋白酶依賴性寄生機制與影響宿主Th1／Th2型免疫應答平衡的分子機制，可從根本上認識半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗對宿主的保護原理，為早日實現高效重組半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗的上市奠定理論與實驗基礎。目前通過實驗已經證實了應用半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗防治對哺乳動物危害性極強的吸蟲、原蟲等寄生蟲的效果要優于普通藥物與傳統疫苗，使人們對寄生蟲疾病防治的概念上升到一個新層次。半胱氨酸蛋白酶核酸疫苗在對經濟動物寄生蟲的防治中也將發揮其安全、環保、高效等優勢，進而大幅降低因寄生蟲病治療困難而帶來的經濟損失。因此未來利用半胱氨酸蛋白酶作為核酸疫苗防治寄生蟲感染將具有廣闊的應用前景。

［1］Gómez D，Bartholomew J，Sunyer J O.Biology and mucosal immunity to myxozoans［J］.Developmental and Comparative Immunology，2014，43（2）：243－256.

［2］齊文娟，方 強.寄生蟲病DNA疫苗研究進展［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2011，23（3）：340－344.

［3］任一鑫，戴曉冬，孫明忠，等.寄生蟲與宿主的免疫關系［J］.中國微生態學雜志，2014，26（1）：122－124.

［4］Sibley L D.The roles of intramembrane proteases in protozoan parasites［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2013，1828（12）：2908－2915

［5］Louise von Gersdorff J?gensen，Kurt Buchmann.Cysteine proteases as potentialantigens in antiparasitic DNA vaccines［J］.Vaccine，2011，29（34）：5575－5583.

［6］Jankovic D，Aslund L，Oswald I P，et al.Calpain is the target antigen of a Th1 clone that transfers protective immunity againstSchistosoma mansoni［J］.Immunol，1996，157（2）：806－814.

［7］Schnapp Anita R，Eickhoff Chris S，Sizemore Donata，et al.Cruzipain induces both mucosal and systemic protection againstTrypanosoma cruziin mice［J］.Infection and Immunity，2002，70（9）：5065－5074.

［8］Pollock K G，McNeil K S，Mottram J C，et al.TheLeishmania mexicanacysteine protease， CPB2.8， induces potent Th2 responses［J］.Immunol，2003，170（4）：1746－1753.

［9］Cameron P，McGachy A，Anderson M，et al.Inhibition of lipopolysaccharide－induced macrophage IL－12 production byLeishmania mexicanaamastigotes：the role of cysteine peptidases and the NF－kappaB signaling pathway［J］.Immunol，2004，173（5）：3297－3304.

［10］Swenerton R K，Zhang S，Sajid M，et al.The oligopeptidase B ofLeishmaniaregulates parasite enolase and immune evasion［J］.The Journal of Biological Chemistry，2011，286（1）：429－440.

［11］Buttle D J，Mort J S.Cysteine protease，Biomedical Sciences［M］／／Encyclopedia of Biological Chemistry（second edition）.2013：589－592.

［12］Silva－Almeida M，Souza－Silva F，Pereira B A，et al.Overview of the organization of protease genes in the genome ofLeishmaniaspp.［J］.Parasites＆Vectors，2014，7：387.

［13］宋軍科，才學鵬，駱學農，等.寄生蟲半胱氨酸蛋白酶研究進展［J］.動物醫學進展，2011，32（12）：95－98.

［14］El－Ahwany E，Rabia I，Nagy F，et al.Protective role of purified cysteine proteinasesagainstFasciolagiganticainfection in experimental animals［J］.The Korean Journal of Parasitology，2012，50（1）：45－51.

［15］Sansri V，Changklungmoa N，Chaichanasak P，et al.Molecular cloning， characterization and functional analysis of a novel juvenile－specific cathepsin L ofFasciola gigantica［J］.Acta Tropica，2013，128（1）：76－84.

［16］Lee J，Kim J H，Sohn H J，et al.Novel cathepsin B and cathepsin B－like cysteine protease ofNaegleria fowleriexcretory－secretory proteins and their biochemical properties［J］.Parasitology Research，2014，113（8）：2765－2776.

［17］McKerrow J H，Caffrey C，Kelly B，et al.Proteases in parasitic diseases［J］.Annu Rev Pathol，2006，1：497－536.

［18］He G Z，Deng S X，An C W.Evaluation of the efficacy of a recombinantEntamoeba histolyticacysteine proteinase（EhCP112）antigen in minipig［J］.Experimental Parasitology，2012，131（2）：258－260.

［19］Pereira B A，Britto C，Alves C R.Expression of infection－related genes in parasites and host during murine experimental infection withLeishmania（Leishmania）amazonensis［J］.Microbial Pathogenesis，2012，52（2）：101－108.

［20］ Das A，Ali N.Combining cationic liposomal delivery with MPL－TDM for cysteine protease cocktail vaccination againstLeish?mania donovani：evidence for antigen synergy and protection［J］.PLoS Neglected Tropical Diseases，2014，8（8）：e3091.

［21］Dumonteil E，Maria Jesus R S，Javier E O，et al.DNA vaccines induce partialprotection againstLeishmaniamexicana［J］.Vaccine，2003，21（17／18）：2161－2168.

［22］Tan Chung－Wei，Jesudhasan Palmy，Woo Patrick T K.Towards a metalloprotease－DNA vaccine against piscine cryptobiosis caused byCryptobia salmositica［J］.Parasitology Research，2008，102（2）：265－275.

［23］Lee Ji－Sook，Kim In Sik，Sohn Woon－Mok，et al.Vaccination with DNA encoding cysteine proteinaseconfers protective immune response to rats infected withClonorchis sinensis［J］.Vaccine，2006，24（13）：2358－2366.

［24］Ahmad G，Torben W，Zhang W，et al.Sm－p80－based DNA vac?cine formulation induces potent protective immunity againstSchis?tosoma mansoni［J］.Parasite Immunol，2009，31（3）：156－161.

［25］Garry O Kelley，Mark A Adkison，Christian M Leutenegger，et al.Myxobolus cerebralis：identification of a cathepsin Z－like protease gene （MyxCP －1） expressed during parasite development in rainbow trout，Oncorhynchusmykiss［J］. Experimental Parasitology，2003，105（3／4）：201－210.

（編輯：李文平）

Research Progress and Application Prospects of Parasite Cysteine Proteases DNA Vaccine

WANG Zhao1，WANG Hao1，QIAN Ai－dong1，LIU Yan－hui2，ZU Xiu－jie2，ZHOU Jing－xiang1?
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Jilin Academy of Fishery Sciences，Changchun130033，China）

Some of the physiological，biochemical and immunological properties of the parasite cysteine proteases had been generalized.The role of the relationship between the enzyme and the host immune response had been described which proved the cysteine proteases could be potential antigens in DNA vaccine.Meanwhile the development and application prospects of parasite cysteine proteases DNA vaccine has been reviewed.

parasites；cysteine protease；DNA vaccine

2014－11－17

A

1002－1280（2015）01－0060－05

S852.7

吉林省自然科學基金（20140101035JC）

王 釗，研究生，從事粘孢子蟲研究工作。

周井祥。E－mail：zhjxnd＠126.com