高脂膳食與運動對小鼠腦內cAMP反應元件結合蛋白基因表達的影響

云少君 喬 欣 李 蔓 魏守剛

(山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太原 030801)

cAMP反應元件結合蛋白(CREB)能夠調節神經元生成、突觸可塑性及學習記憶等方面〔1〕，其異常表達及活性變化參與了某些神經退行性疾病的病理生理過程〔2〕。近年來許多研究顯示〔3〕腦老化性學習記憶功能障礙的原因之一是衰老過程中腦神經元大量凋亡。生活方式能影響神經功能，特別是富含脂類的飲食結構能夠導致老化過程中的認知障礙〔4〕，加速阿爾茨海默病(AD)的癡呆過程〔5〕，而運動是抗衰老保護腦健康的有效措施之一。本研究擬觀察腦老化情況下CREB基因的表達情況，同時進行高脂膳食和運動干預，探討不同生活方式對腦老化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 70只雄性美國癌癥研究所(ICR)小鼠按體重隨機分為普通對照組、高脂對照組、運動對照組、普通腦老化組、腦老化+高脂組、腦老化+運動組及腦老化+高脂+運動組。腦老化小鼠模型的建立參見文獻〔6〕，本實驗皮下注射D-半乳糖的劑量調整為50 mg/kg(1次/d，連續10 w)，對照組小鼠注射等量生理鹽水。按文獻〔7〕特制高脂鼠料:79%基礎飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇(軍事醫學科學院動物科學部加工)。小鼠運動訓練方案參照文獻〔8，9〕進行，經預實驗調整后確定為:小鼠在電動跑臺上每周訓練6 d，每天跑步500 m，其中第1周以10 m/min的速度運動，以后每周跑步速度遞增5 m/min，至第4周增至25 m/min后維持該速度運動直至實驗結束，實驗期共10 w。

1.2 Morris水迷宮試驗 參照文獻〔10〕進行 Morris水迷宮實驗。本實驗中調整為:水迷宮試驗每天測試1次，共進行7 d，學習期為開始3 d，將小鼠放在站臺上熟悉15 s后再下水航行，若2 min內不能自動找到站臺，則人工幫助其登陸站臺并停留15 s以學習記憶;鞏固期為其后2 d，小鼠自由航行2 min尋停站臺，人工不再幫助其登陸站臺。第6、7天進行正式測試，逃避潛伏期測試數據平均值用于小鼠學習記憶能力的分析，若2 min內不能自動找到站臺則記錄為逃避潛伏期120 s。

1.3 CREB基因表達測定(RT-PCR法)Morris水迷宮實驗結束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取腦組織(去除小腦)稱重，置于液氮速凍后于－70℃冰箱保存待測。以RT-PCR法測定CREB基因的表達水平。具體實驗操作見相關試劑盒說明書。引物序列:CREB:5'-TCA GCCGGGTACTACCAT TC-3'及5'-TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3'。內參照β-actin:5'-GTT ACCAAC TGG GAC GAC A-3'及5'-GGA ACC GCT CGT TGC CAA-3'。PCR 擴增條件:CREB:94℃ 3 min，94℃ 30 s→55℃30 s→72℃ 1 min，30 個循環后，72℃ 10 min。β-actin:94℃3 min，94℃ 45 s→60℃ 60 s→72℃ 60 s，35 個循環后，72℃5 min。采用凝膠成像分析系統對擴增產物的電泳分離條帶進行灰度值測定，計算目的基因擴增產物與內參基因擴增產物灰度值的比值表示目的基因表達的相對量。

1.4 統計學分析 用SPSS17.0進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠學習記憶能力測評 Morris水迷宮行為學實驗結果表明腦老化小鼠模型建模成功。普通腦老化組〔(59.33±25.54)s〕與腦老化+高脂組〔(56.42±10.20)〕s小鼠的逃避潛伏期均大于普通對照組〔(32.58±8.99)〕s(P＜0.05)。腦老化+運動組小鼠的逃避潛伏期〔(24.75±8.72)〕s低于普通腦老化組(P＜0.05)，與普通對照組相比差異顯著。腦老化+高脂+運動組小鼠的逃避潛伏期〔(53.67±14.94)s〕大于普通對照組(P＜0.05)，與普通腦老化組相比無統計學差異。高脂對照組小鼠的逃避潛伏期〔(58.10±4.74)〕s大于普通對照組(P＜0.05)，運動對照組〔(31.17±8.98)s〕與普通對照組比較差異無統計學意義。

2.2 CREB基因表達情況 普通腦老化組小鼠腦CREB基因表達水平(0.68±0.35)低于普通對照組(3.24±0.80)(P＜0.05)。腦老化+高脂組小鼠腦CREB基因表達水平(0.58±0.25)低于普通對照組(P＜0.05)，與普通腦老化組之間無統計學差異。腦老化+運動組小鼠腦CREB基因表達水平(2.01±1.28)高于腦老化組(P＜0.05)，與普通對照組之間差異無統計學意義。腦老化+高脂+運動組(0.99±0.66)與普通對照組相比表達量降低(P＜0.05);與普通腦老化組相比雖有所增高，但無統計學差異。與普通對照組相比，高脂對照組(0.52±0.12)有所降低(P＜0.05);運動對照組CREB基因表達水平(1.73±0.20)差異無統計學意義。

3 討論

本實驗結果表明:(1)D-半乳糖誘導性腦老化小鼠CREB基因表達下降，這種變化與以前關于神經退行性疾病和神經元凋亡關系的報道相似〔11〕。作為細胞存活因子信息轉導途徑中的最后一個成分，通過其分子中Ser-133的磷酸化，CREB由無活性型轉變成活性型，結合到相關基因，引起靶基因的表達〔11，12〕，而發揮抑制凋亡作用。對正常老齡大鼠的研究，也發現有腦神經元大量凋亡現象，因為神經系統接受、處理和儲存信息的能力在某種程度上與細胞數量相關，因此這可能是腦老化性學習記憶功能障礙的原因之一。(2)高脂膳食使小鼠的CREB基因表達下降，但是其與D-半乳糖并無明顯的協同作用。高脂膳食使血管和血液流變學參數發生負性改變，能夠導致血管彈性下降、血液黏滯度增加、血流速度減緩等，造成大腦供血供氧不足，并且長期脂肪酸攝入過多，使脂質過氧化物產生增加。這些變化直接促進腦內自由基形成增多，而腦組織由于相對地缺乏GSH等抗氧化物質，故易發生過氧化反應，進一步導致腦組織氧化損傷，進而引起神經元的過度凋亡。(3)運動可以防止腦老化小鼠的CREB基因表達下調，延緩腦老化。腦老化過程中給予運動干預能夠抵制CREB mRNA表達的不斷下調，對抗神經元凋亡，從而達到延緩腦老化的作用。本研究還顯示，運動對正常小鼠腦內CREB基因表達并無明顯上調作用，運動通過影響神經元凋亡而保護腦健康的效應可能更主要的體現在抗腦老化過程中。

因此，本研究提示老年人避免長期高脂膳食及堅持運動鍛煉對于預防腦老化、促進腦健康有長遠的現實意義。

1 宋海龍，鄭 焱，王曉民.CREB信號通路在神經系統中的調控及功能〔J〕．中國生物化學與分子生物學報，2013;29(9):797-804.

2 Leutgeb JK，Frey JU，Behnisch T.Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures〔J〕．Neuroscience，2005;131(3):601-10.

3 Winter E.Effects of an extract of Ginkgo biloba on learning and memory in mice〔J〕．Pharmacol Biochem Behav，1991;38(1):109.

4 Chen KS，Masliah E，Mallory M，et al．Synatic loss in cognitively impaired aged rats is ameliorated by chronic human nerve growth factor infusion〔J〕．Neuroscience，1995;68(1):19-27.

5 Kalmijn S，Foley D，White L，et al．Metabolic cardiovascular syndrome and risk of dementia in Japanese-American elderly men:the Honolulu-A-sia aging study〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000;20:2255-60.

6 龐在英，李桂榮，杜怡峰.海風藤提取物對D-半乳糖腦老化模型小鼠行為、海馬神經細胞線粒體膜電位及凋亡的影響〔J〕．中國老年學雜志，2007;16(27):1555-57.

7 Koudinov AR，Koudinova NV.Essential role for cholesterol in synaptic plasticity and neuronal degeneration〔J〕．FASEB J，2001;15:1858-60.

8 程志清，龔立波，姚 立.強迫跑步法建立 BALB/C小鼠心氣虛證模型〔J〕．浙江中醫學院學報，2003;27(6):42-5.

9 杜少武，吳紀饒.復方白蟻制劑對訓練大鼠血清睪酮、皮質醇的影響〔J〕．中國運動醫學雜志，2005;24(6):714-5.

10 高秋菊，勾凌燕，王 憬，等.不同劑量碘對迷宮前后鼠腦神經遞質的影響〔J〕．中國公共衛生，2005;21(6):710-11.

11 Yuan J，Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕．Nature，2000;407(7):802-9.

12 Lambeng N，Michel PP，Brugg B，et al．Mechanisms of apoptosis in PC12 cells irreversibly differentiated with nerve growth factor and cyclic AMP〔J〕．Brain Res，1999;821(1):60-8.