模式動物斑馬魚在組織屏障發育及功能研究中的進展

李強，張晶晶，2*

（1.廣東醫學院附屬醫院神經內科，廣東湛江 524001；2.廣東醫學院附屬醫院臨床醫學研究中心，廣東湛江 524001）

研究進展

模式動物斑馬魚在組織屏障發育及功能研究中的進展

李強1，張晶晶1，2*

（1.廣東醫學院附屬醫院神經內科，廣東湛江 524001；2.廣東醫學院附屬醫院臨床醫學研究中心，廣東湛江 524001）

斑馬魚作為一種新型的模式動物，以其獨特的優勢，已經成為現代遺傳學、發育生物學等研究的重要模式生物。與人類及其他高等脊椎動物相似，斑馬魚同樣具有不同的組織屏障系統。近年來，此領域的研究者利用斑馬魚對血腦屏障等組織屏障的研究取得了重要的進展。這對揭示諸多生理屏障相關的人類疾病的發病機制，以及探討通過調控組織屏障通透性來達到藥物有效投遞的可行性等研究具有重要的啟示作用。本文將介紹近年來斑馬魚作為模式動物在血腦屏障、血-視網膜屏障、皮膚表皮屏障、腸黏膜上皮屏障等組織屏障發育和功能研究中的最新進展。

斑馬魚；組織屏障；血腦屏障；發育；疾病發生

斑馬魚起源于印度，屬輻鰭亞綱鯉科短擔尼爾魚屬，是國際標準化組織認可的5種魚類實驗動物之一。斑馬魚繁殖能力強，能夠體外受精和發育，其胚胎發育速度快，繁殖周期短，且胚胎和幼魚身體透明，便于形態學觀察。1981年，Oregon大學的George Streisinger［1］首次介紹了斑馬魚實驗技術方法，為人類利用斑馬魚作為模式動物研究人類疾病的發病機制、尋找疾病治療方法奠定了基礎。經過30余年的發展，斑馬魚已成為可運用于遺傳、發育、藥理和毒理學等多領域研究的重要模式生物。斑馬魚基因測序工程的完成，揭示其基因組與人類基因組的相似性高達87%，與人類有著相似的病理特征和信號傳導通路，同時斑馬魚大部分組織器官在解剖學、生理學和分子水平上已被證實與哺乳動物類似，這就意味著利用斑馬魚可以作為研究大多數人類疾病的模式生物。本文擬對近年來斑馬魚在血腦屏障、血-視網膜屏障、皮膚表皮屏障、腸黏膜上皮屏障等組織屏障中的最新研究進展作一綜述。

1 組織屏障簡介

組織屏障是生物種系在長期進化過程中形成的機體抵抗外來有害物質（特別是細菌、病毒等微生物）入侵機體的重要結構，對維持機體內環境的穩定、各器官的功能以及正常的生命活動具有重要的作用。在人體內，組織屏障主要包括血腦屏障、血-視網膜屏障、皮膚上皮屏障、腸黏膜上皮屏障等。雖然這些屏障的功能各不相同，但主要都是由緊密連接（tight junction，TJ）、粘附連接（adhesion junction，AJ）和橋粒等結構組成，這些結構相互聯系、相互作用，共同形成完整的屏障結構，對機體發揮重要的保護作用。

1.1 緊密連接

緊密連接主要由跨膜蛋白和胞質附著蛋白兩種成分構成，是構成組織屏障的重要結構，位于兩個相鄰內皮或上皮細胞間，能夠封閉細胞間隙，使相鄰的細胞緊密貼合在一起，形成細胞間天然的物理屏障，起著選擇性通透、維持細胞極性和細胞內環境穩態的作用。除此之外，最近的研究顯示，TJ還參與上皮細胞增殖分化、基因的轉錄和調控等活動［2，3］。TJ跨膜結構主要由跨膜蛋白occludin，claudin和連接黏附分子（junction adhesion molecules，JAMs）組成。其中claudin和occludin起主要作用，尤以claudin的功能最為重要，它是構成緊密連接的主要骨架蛋白［4］，能與TJ的其他成分共同作用，形成TJ嵴線。1998年，日本的Shoichiro Tsukita研究團隊首次發現并報道了claudin1和claudin2為TJ嵴線的整體成分［5］。之后的研究表明，claudin為多基因家族，至今，已有20多個claudin家族的成員在人類和小鼠體內被發現［6］，50余個在斑馬魚中被發現［7］。利用小鼠等哺乳動物細胞模型研究顯示，不同claudin成員在各種組織中的分布及功能不同。TJ中每一種claudin都有自己獨特的細胞間隙離子選擇性［8］，這種獨特的選擇性增加了緊密連接的結構和功能的多樣性，為不同組織類型屏障功能的多樣性提供了分子學依據。同時，同種或異種的claudin可形成聚合體并與鄰近的claudin相互作用構成胞間連接骨架。不同的claudin亞型對細胞間隙滲透性的調控通常不同的，這可能是由于表達不同claudin的內皮細胞和上皮細胞的不同屬性決定的［9，10］。也有證據顯示某些claudin的亞型能夠形成特殊的孔或離子通道，用來調節離子的轉運［11，12］。在對模式動物斑馬魚的研究中發現，許多在人體和小鼠中表達的claudin蛋白也能夠在斑馬魚體內檢測到，如claudin5a主要分布在斑馬魚腦腔內，claudin-b在斑馬魚皮膚表皮屏障形成過程中起著重要的作用。除此之外，claudin-1，-2，7，-10，-11，-12，-h，-e，-d，-c等claudin家族的其他成員也先后在斑馬魚體內被檢測到［13］，這使得斑馬魚成為研究細胞間緊密連接的重要模式動物，從而為我們進一步研究組織屏障的功能和調節提供了一種很好動物模型。

1.2 粘附連接

粘附連接是相鄰細胞通過細胞膜蛋白相互連接，在Ca2+的參與下，由單次跨膜的cadherin介導，在細胞膜的胞質區域通過多種蛋白與微絲相連接形成貫穿相鄰細胞的細胞連接，包括與鄰近上皮細胞形成的粘著帶以及與成熟成纖維細胞形成的粘著斑。AJ是不同類型細胞中均普遍存在的一種細胞與細胞之間連接的結構［14］，在細胞與細胞的粘附中起著關鍵作用。AJ需要Ca2+的參與，由相鄰細胞通過細胞膜的表面蛋白相互連接。目前已發現參與粘附連接形成的蛋白主要包括鈣粘蛋白家族（cadherin family）、連接素家族（nectin family）以及與claudin、occludin和JAM一起構成細胞粘附分子（cell adhesion molecules，CAMs）家族。其中形成粘附連接的鈣粘蛋白cadherin是鈣離子依賴性的介導同質性細胞粘附的單次跨膜糖蛋白，主要包括E-cadherin，N-cadherin和P-cadherin三種，在粘附連接復合體中起著關鍵作用［15］。然而，E-cadherin是上皮細胞主要的鈣粘蛋白，廣泛分布于成熟組織和胚胎的上皮組織中，在組織形成、胚胎發育、細胞粘附和細胞間信息傳遞等多種生物學過程中起著重要的調控作用；N-cadherin主要表達于神經和肌肉組織的細胞內；而P-cadherin則主要表達在胚胎細胞中。此外，鈣粘蛋白還存在很多種亞型，如K-cadherin（kidney-cadherin）和 R-cadherin（retinal-cadherin）等。經研究發現，人E-cadherin基因編碼882個氨基酸，分子量約100×103，分為胞外區、跨膜區和胞內區三部分。其中胞內結構域上含有p120-catenin結合位點和β-catenin結合位點，可通過βcatenin等錨定蛋白與F-actin細胞骨架相連［16］；而胞外區含有5個由110個氨基酸組成的同源重復序列結構域（EC1-EC5），每個重復序列均有獨立的鈣離子結合位點，能夠形成依賴鈣離子的同源二聚體，從而與鄰近細胞的同種分子形成特異的相互作用。在對斑馬魚的研究中也發現，如cadherin-6，在斑馬魚視網膜的形成過程中具有重要的作用［17］，這說明E-cadherin對調節細胞之間粘附的發生起著重要作用［18］。連接素家族蛋白是Ca2+非依賴的免疫球蛋白樣細胞粘附分子，包括四個成員，分別為nectin-1，nectin-2，nectin-3，nectin-4，其中，nectin-1，nectin-2，nectin-3又分別因剪切方式的不同而產生多種亞型［19］。

2 內皮屏障系統

內皮屏障系統主要是由內皮細胞和基膜構成。通過對小鼠等哺乳動物的研究顯示，血管內皮屏障系統的調節機制非常復雜，對機體具有重要的作用。通過對血管通透性的研究顯示，許多有害因素均可損傷血管內皮細胞，導致其通透性改變，引起組織、器官水腫和功能障礙；通過對這些有害因素對內皮屏障系統的損傷，能使我們對這些有害因素的損傷機制及藥物治療進行更深入的研究。模式動物斑馬魚體內的內皮屏障系統主要包括血腦屏障及血-視網膜兩大內皮屏障系統，下面就這兩大系統做主要介紹。

2.1 血腦屏障

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是位于血液與神經細胞之間，系由腦毛細血管內皮細胞和內皮細胞的緊密連接、星形膠質細胞以及基底膜所組成的一個細胞聯合體。它對維持中樞神經系統的內環境穩定起著重要作用。腦毛細血管內皮細胞沒有窗孔，缺少收縮性蛋白，彼此之間能夠形成較嚴密的緊密連接，從而構成一個物理屏障，使蛋白質分子及其他大分子物質難以透過，也可限制離子和非電解質通過。研究表明，TJ存在孔通道和滲漏通道，它們具有不同的結構基礎和調節機制。其中孔通道為離子選擇性通道，主要由claudin胞外環狀結構域決定其離子選擇性。滲漏通道則主要與大分子物質轉運有關。兩種通道能夠通過各自的調節機制影響TJ對物質的滲透性。因此，TJ被認為是血腦屏障功能發揮作用的重要結構基礎。

近年來，斑馬魚逐漸成為研究血腦屏障形成和發育以及藥物滲透作用的一種理想的模式動物。Isogai等［20］利用微血管造影術研究注射Berlin-blue染料的1 dpf-7 dpf（受精后天數，days post fertilization，dpf）的斑馬魚，結果表明斑馬魚循環系統在24 hpf（受精后小時數，hours post fertilization，hpf）左右出現。此期間斑馬魚的血管形成過程是高度動態變化的，但又遵循相對固定的模式。Jeong等［21］利用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）進行血管內注射的觀察結果表明，斑馬魚同其他脊椎動物一樣，具有以內皮細胞為基礎的血腦屏障。2.5 dpf之前，其頭部主要血管形成為血管發生方式，自此之后，一定數量的中央動脈開始刺入腦實質，大量的微血管網開始形成。隨著血管網的逐漸形成，血腦屏障也開始發育，并逐漸形成。Claudin-5和ZO-1在表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）的微血管的內皮細胞中檢測到，這表明在3 dpf時斑馬魚已具備以TJ為基礎的血腦屏障，而斑馬魚的這種循環系統，能夠為其早期發育提供重要保障。

Claudin-5是構成血腦屏障緊密連接的重要蛋白，其在斑馬魚血腦屏障的形成過程中起著非常重要的作用。在斑馬魚體內共檢測到兩種claudin-5，分別是claudin-5a和claudin-5b，且兩者具有高度的同源性。Xie等［22］通過建立雙轉基因斑馬魚Tg（lfabp：DBP-EGFP）模型，將熒光染料注入不同時期的斑馬魚胚胎，通過對斑馬魚胚胎期前4天claudin-5a和claudin-5b的檢測，進一步證實斑馬魚血腦屏障開始發育是在3 dpf。Zhang等［23］通過對斑馬魚腦室形成和發育的研究，發現claudin-5a與腦室膨脹有密切關系，而腦室膨脹則是形成血腦屏障最至關重要的一步，claudin-5a缺失會影響斑馬魚神經內皮細胞旁路的屏障功能，并導致緊密連接不完整和腦室膨脹障礙，從而導致血腦屏障的形成障礙。此外，claudin-5b能夠特異性的分布在脈管系統，有研究表明 claudin-5b在節間血管（intersegmental vessel，IVS）的生成過程中起著重要的作用［24］，但其在血腦屏障中的作用需進一步研究。除了claudin-5之外，claudin家族的其他成員（如claudin-1，-j，-7，-10，-11，-12，-e，-d）也在斑馬魚腦內被發現，但在斑馬魚血腦屏障的發育形成過程的具體作用目前還需進一步研究［13］。

ZO-1（zonula occludens-1）既是組成AJ的主要結構，也是構成TJ的重要成分之一，為TJ的許多跨膜蛋白和細胞質緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺。有研究發現，由于ZO-1結構和功能與緊密連接的其他成員密切相關，多數情況下只要ZO-1受到破壞，緊密連接的功能多隨之發生變化。通過對模式動物斑馬魚血腦屏障的研究發現，從3 dpf開始，在斑馬魚魚卵的大腦微血管中就可檢測到ZO-1蛋白，并且該蛋白伴隨血腦屏障成熟的整個過程這再一次證實斑馬魚血腦屏障開始發育是在3 dpf［21］。

Occludin是第一個被鑒定出來的跨膜蛋白［25］。目前認為，其主要功能可能是參與調控TJs間的信號轉導［2］。但其在斑馬魚血腦屏障中的作用尚需進一步證實。

2.2 血-視網膜屏障

血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）由視網膜血管和視網膜色素上皮共同組成。視網膜毛細血管內皮則形成血-視網膜內屏障（blood-retinal inner barrier），視網膜色素上皮則形成血-視網膜外屏障（blood-retinal outer barrier）。屏障功能依賴于緊密連接，限制細胞間水溶性分子的運動，防止這些分子進入視網膜。電子顯微鏡顯示圍繞視網膜毛細血管內皮細胞和視網膜色素上皮頂端有大量阻塞小帶，大分子和離子不能從循環中被動的擴散進入視網膜，但可與選擇性的主動運輸聯系起來。斑馬魚眼的發育與人類非常相似，經過數十年的研究，已逐漸成為研究血-視網膜屏障的理想模式動物。Alvarez等通過對斑馬魚視網膜血管發育過程的研究發現，在透明血管發育成視網膜血管的過程中，血管并未退化。同時，成年斑馬魚的視網膜血管內皮細胞及其周圍細胞具有緊密連接結構［26，27］。有研究顯示，在斑馬魚受精后3 dpf，其眼內的血管中即可檢測到緊密連接蛋白claudin-5，這表明斑馬魚BRB形成與BBB一樣，亦是在受精后3天（3 dpf），同時通過對ZO-1蛋白的檢測，發現ZO-1在眼內的表達比claudin-5更早［22］。除了claudin蛋白之外，cadherin也在斑馬魚視網膜形成中具有重要作用。Liu等通過對斑馬魚視網膜的發育過程的研究發現，在斑馬魚受精后32 h，便可在斑馬魚的視神經和視網膜前腹側區域檢測到cadherin-6，而此區域是視網膜細胞最早分化的區域，若阻止cadherin-6的表達，則會導致視網膜細胞的形成障礙［19］。

3 上皮屏障系統

上皮屏障系統主要是由上皮細胞和基膜等結構構成，能夠通過相鄰細胞間的相互連接而形成屏障，使機體免受外來有害物質的損傷，對維持機體的內環境穩定具有重要的作用。目前在斑馬魚系統中研究較多的上皮屏障主要有皮膚表皮屏障及腸黏膜上皮屏障，下面就這兩種屏障做進一步介紹。

3.1 皮膚表皮屏障

斑馬魚表皮為其內部結構和外界環境提供了一個必要的屏障結構，在胚胎期14 hpf，表皮即可完全包裹胚胎［28］，隨著胚胎的發育，其角質形成細胞也逐漸增殖，可在成魚時分化形成三層：外層，中間層及基底層［29］，但各層間相互粘連，形成TJ。Raymond等使用反向遺傳法阻止斑馬魚幼魚claudin-b蛋白的翻譯，發現claudin-b敲低后導致斑馬魚幼魚皮膚表皮細胞間隙的滲透性增加，Na+丟失，使整個機體的Na+減少，但Clˉ并未發生明顯改變，從而證明了claudin-b在調節斑馬魚皮膚上表皮細胞滲透性和Na+轉運中起著重要的作用［30］。Zhang等［31］利用僅含194到319位氨基酸的產氣莢膜梭菌內毒素（cCPE194ˉ319）肽段來調控斑馬魚幼魚表皮的滲透性，發現cCPE194ˉ319能夠特定的從上皮細胞移走claudin-b，使單層細胞的緊密連接中斷。通過4 kDa熒光染料擴散實驗分析發現表皮屏障的滲透性增加主要是因為cCPE194ˉ319導致的，電子顯微鏡結果顯示移除cCPE194ˉ319能夠使上皮細胞間的TJs結構恢復。以上結果表明使用cCPE194ˉ319能夠調控claudin-b從而控制表皮屏障的瞬時開關，這就使得斑馬魚可以作為新的模式動物，來研究借助cCPE提高藥物通過組織屏障的可能性。除此之外，Kiener等［32］通過對斑馬魚胚胎期表皮屏障形成過程的研究發現，Tjp/ZO-3首先是在其胚胎的周圍層（enveloping layer，EVL）被檢測到，阻止Tjp/ZO-3的表達，將會導致EVL的發育缺陷，從而導致胚胎對滲透壓力的敏感性增加。因此Tjp/ZO-3在斑馬魚胚胎期表皮屏障的功能也具有重要作用。

3.2 腸黏膜上皮屏障

人體腸道內棲息著大量的微生物，這些微生物在長期進化過程中和宿主形成了共生關系。正常情況下并不損害機體健康，這完全依賴機體完整的腸道黏膜屏障功能。在正常情況下，腸道的屏障作用可有效的阻擋腸道內500多種、濃度高達1012個/g的腸道內寄生菌及其毒素向腸腔外組織、器官移位，防止機體受內源性微生物及其毒素的侵害。腸道黏膜屏障主要是由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障四部分組成，其中以機械屏障及免疫屏障最為重要。成年斑馬魚沒有胃，其腸道分為前腸、中腸和后腸，通過免疫組織化學檢測發現其腸道上皮結構主要由柱狀細胞、杯狀細胞及內分泌細胞等組成，細胞之間由TJs、AJs組成物理屏障以限制腸腔內容物進入機體。斑馬魚的消化系統的快速發育大約是在18 hpf［33］，其腸管逐漸形成，隨著腸道與外界環境相通，微生物也逐漸進入斑馬魚腸道內。Wallace等［34］通過對斑馬魚腸道形成及發育的研究發現，在斑馬魚50 hpf時，大多數腸道上皮細胞即可觀察到散亂的ZO-1，在74 hpf，ZO-1更加明顯。在這個時期，通過電子顯微鏡可觀察到上皮細胞間的橋粒。有研究表明［35］，由免疫細胞和上皮細胞分泌的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），若其分泌過多，可導致斑馬魚腸上皮屏障功能障礙，從而導致炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）的發生。該結果說明，TNF對維持腸道的屏障功能具有重要的作用。

4 利用斑馬魚進行其他組織屏障的研究

斑馬魚作為研究組織屏障結構和功能的理想模式動物，除上述幾種組織屏障外，斑馬魚體內還存在腎小球濾過屏障，能夠為腎臟發育和功能的研究提供一個適用的生物模型。斑馬魚腎臟結構較為簡單，其幼魚的前腎僅由2個腎單位組成，并通過2個腎小管連接其腎小球與前腎導管，前腎導管在尾部匯合通到泄殖腔。斑馬魚的腎小球由有孔的毛細血管內皮細胞、毛細血管基底膜（GBM）、足細胞等組成，具有與高等脊椎動物腎臟一樣的細胞組成。Kramer等［36］學者通過對斑馬魚腎小球電子顯微鏡觀察，結果表明，斑馬魚足細胞在足狀凸起部分形成的隔膜類似于哺乳動物腎臟足細胞，并已證明，斑馬魚在24 hpf時期的同源基因podocin和nephrin均能夠特異表達于足細胞中，且該基因在腎臟足細胞隔膜的形成中是必不可少的。

Majumdar等研究發現，腎小球毛細血管內皮細胞表達VEGF受體和其早期標志物flk-1，而flk-1陽性的內皮細胞能夠侵入腎小球上皮細胞形成腎小球毛細血管袢。但是當背脊動脈發育發生缺陷而無法形成正常的腎小球脈管系統時，足細胞仍然能夠繼續表達WT1和VEGF，從該結果推斷，足細胞似乎能夠從附近的靜脈俘獲flk-1陽性的內皮細胞以形成具有功能的腎小球。可見，足細胞通過表達VEGF在吸引和聚集腎小球毛細血管叢的形成中起著重要作用［38］。此外，Serluca等［37］研究表明，血管流量及腎小球基底膜的降解與再塑［38］也是毛細血管形成過程中的兩個必需因素。

5 總結

人體時刻都與外界接觸并進行物質交換，為了防范外界不良因素對機體的侵犯，人體具有數重天然保護性“墻”―組織屏障，作為阻止外來有害物質入侵機體的重要結構。斑馬魚各組織屏障的發育形成過程及結構功能同哺乳動物相似，這就使得斑馬魚成為研究組織屏障結構、功能的理想模型。通過電鏡技術及分子生物學技術研究發現，斑馬魚組織屏障主要是由TJ、AJ、橋粒等結構組成，而這些結構主要是由occludin，claudin，cadherin，ZO等蛋白組成，這些蛋白伴隨著各組織屏障發育形成的全過程。對這些蛋白形成過程、結構和功能的研究，使得我們對早期發現疾病、研究疾病的發病機制及藥物如何通過這些屏障到達靶器官提供了重要的基礎。隨著免疫熒光技術的發展、轉基因斑馬魚模型的建立，世界各國科學工作者在研究組織屏障中也取得了重大的成果。盡管如此，由于各連接蛋白家族數量眾多且功能不盡相同，各組織屏障所表達的連接蛋白又各不相同，這就為我們如何發現各組織屏障中的關鍵蛋白帶來難題。雖然有的屏障結構研究日漸清晰，但其與疾病的發生、發展關系仍需進一步探究.如何利用這些研究成果，使藥物能夠更加容易通過這些屏障結構，從而達到治療疾病的目的仍待解決。且這些研究成果都是通過動物模型研究所得，在應用于人類時是否具有差異性，仍需繼續研究。

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Research progress on the development and functions of tissue barriers using zebrafish model

LIQiang1，ZHANG Jing-jing1，2
（1.Department of Neurology；2.Clinical Research Center，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang Guangdong 524001，China）

Zebrafish has been widely used as an importantmodel system in research fields of genetic and developmental biology over the past20 years.Similar to themammalians and other vertebrate animals，zebrafish also has various tissue barriers.In recent years，more and more important progress of tissue barrier studies have been achieved using zebrafish as in vivo model，such as blood-brain barrier.These findings contribute to the understanding of themechanisms of diseases caused by the disorders of physiological barriers.Italso helpswith themodulation of the permeability of tissue barriers for drug delivery.This review summaries recent progress of zebrafish applications in the study of tissue barriers，such as blood-brain barrier，blood-retina barrier，epidermal barrier，etc.

Zebrafish；Tissue barrier；Blood-brain barrier；Development；Pathogenesis.

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0523-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.016

2015-08-07

國家自然科學基金（31370824，81102524）；廣東省“培養高層次人才特殊支持計劃”專項基金（粵人才辦〔2015〕8號）。

李強，男，碩士研究生，研究方向：腦組織屏障，E-mail：330938901@qq.com。

張晶晶，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：發育神經生物學。E-mail：gdmccrc@163.com。