斑馬魚在生態毒理學研究及環境監測中的應用

劉輝，戴家銀

（1.中國科學院動物生態與保護生物學重點實驗室，中國科學院動物研究所，北京 100101；2.蚌埠醫學院醫學檢驗系，安徽蚌埠 233030）

研究進展

斑馬魚在生態毒理學研究及環境監測中的應用

劉輝1，2，戴家銀1*

（1.中國科學院動物生態與保護生物學重點實驗室，中國科學院動物研究所，北京 100101；2.蚌埠醫學院醫學檢驗系，安徽蚌埠 233030）

斑馬魚作為一種新型的模式動物，由于其易于飼養、體外受精、產卵量大、胚胎透明及體外發育等優點，已經廣泛應用于生物研究的多個領域。近年來，斑馬魚及其胚胎也已經廣泛應用于生態毒理學研究及環境監測領域；并且隨著轉基因斑馬魚技術的建立，斑馬魚及其胚胎將更好地應用于生態毒理學研究和環境監測。

斑馬魚；生態毒理學；環境監測；轉基因

斑馬魚（英文名：zebrafish，拉丁文名：Danio rerio）也稱為藍條魚、花條魚、藍斑馬魚、印度魚或印度斑馬魚等，屬于硬骨魚類，輻鰭亞綱（Actinopterygii），鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），魚丹屬（Danio）。斑馬魚為淡水魚類，原產于孟加拉、印度、巴基斯坦、緬甸和尼泊爾的溪流中，因全身布滿多條深藍色縱紋與相間排列的銀白色或金黃色縱紋，形似斑馬而得名斑馬魚。上世紀70年代，美國科學家首次把斑馬魚引入實驗室研究，自1981年，《Nature》雜志刊登美國遺傳學家George Streisinger關于斑馬魚的論文后，斑馬魚作為一種新型模式動物開始廣泛應用于科學研究。斑馬魚在我國生物科學方面的研究始于1998年，孟安明院士在清華大學建立國內第一家以斑馬魚為模式動物的發育生物學實驗室。發展至今，斑馬魚成為大鼠、小鼠以外第三種廣泛使用的模式動物應用于各領域的科學研究。

目前，斑馬魚信息網絡（Zebrafish Information Network，ZFIN：http：//www.zfin.org/）數據庫已較為完備。在生物學上，斑馬魚和人類基因有高達87%的同源性，大多數人類基因都有斑馬魚的直系同源基因，這意味利用斑馬魚做藥物實驗所得到的結果在多數情況下也適用于人體，因此它被廣泛應用于生命科學實驗研究。它成為幫助人類攻克疑難雜癥的得力助手，被譽為“水中小白鼠”。除了幫助人類了解疾病病理以外，斑馬魚還是環境檢測的“活試劑”，由于斑馬魚對外界環境變化極為敏感，轉基因斑馬魚在遇到一些特定物質的時候體色會發生變化，利用這種特性，部分歐美國家開始在河流湖泊中放養斑馬魚，來實時檢測水質狀況。

1 斑馬魚及其胚胎在生態毒理學領域的應用

1.1 斑馬魚及其胚胎在急性毒性實驗中的應用

魚類急性毒性試驗通常用于評價環境污染物包括工業廢水、農藥、殺蟲劑、除草劑、洗滌劑以及藥物等物質的風險，很多國家也將魚類急性毒性實驗用作常規的廢水檢測模型。斑馬魚胚胎最早應用在生態毒理學領域是Nagel等［1］2002年使用斑馬魚胚胎替代魚類96 h的急性毒性實驗。由于其胚胎和成體的急性毒性結果一致性很好，胚胎在毒性實驗中的應用更能節約試驗時間及成本，德國廢水收費法案中要求把魚類急性毒性實驗替換成斑馬魚胚胎毒性實驗（fish embryo test，FET）［2］。

在斑馬魚急性毒性實驗中，通常要計算斑馬魚胚胎發育過程中三個階段的半致死濃度（median lethal concentration，LC50）：胚胎早期的囊胚期（大約3 hpf），幼魚開口期（72 hpf）和幼魚浮游期（120 hpf）［3］。具體的生物檢測按照經濟合作與發展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）頒布的魚類早期毒性實驗準則進行［4］。

Kovacs等［5］利用斑馬魚和胚胎的急性及亞急性毒性實驗開展了4種環境殘留抗腫瘤藥物的毒性評價，包括：5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、順氯氨鉑（cisplatin，CisPt）、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷（etoposide，ET）和甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM），并認為這四種環境劑量的抗腫瘤藥物屬于低毒性物質，對斑馬魚的毒性作用不大。同時急性試驗發現這些藥物都有抑制DNA復制的作用，仍需要進一步通過慢性毒性實驗進行驗證，所以斑馬魚及其胚胎的急性和亞急性毒性實驗還能為化學品毒性的深入研究提供一些基本信息。

Liu等［6］利用斑馬魚胚胎開展了一種持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs）—全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）的急性毒性研究，發現PFNA對斑馬魚胚胎具有發育毒性，表現出發育遲緩并伴有各種畸形。8 hpf和24 hpf半致死濃度（LC50）分別為 342和 302μmol/L。400 μmol/L暴露條件下所有胚胎在8 hpf全部死亡，胚胎死亡率與畸形率均與PFNA的濃度呈正相關。

1.2 斑馬魚在慢性毒性實驗中的應用

急性毒性實驗的優點是能在較短時間內粗略判斷某種物質的毒性作用，但是，更為真實和全面的反映某種化學物質在環境中的毒性，還需模擬真實環境，開展低濃度和長時間暴露的慢性毒性實驗，因此，斑馬魚作為慢性毒性實驗模型具有顯著優勢，以斑馬魚及其胚胎作為實驗對象有利于節約空間，由于其繁殖量大及周期短等優點能有效的節約實驗成本及時間，更重要的是化學品在流水暴露條件下更貼近于真實水體環境，在這些方面是大、小鼠等嚙齒動物無法比擬的。因此，有毒物質低濃度、長時間暴露實驗更加受到生態毒理學家的關注。OECD還專門制定了關于魚類14d延長毒性試驗的標準實驗方法和觀察化學物質干擾魚類內分泌系統的21d魚類實驗方法［7，8］。

下面從斑馬魚在肝臟毒性、生殖發育及內分泌干擾毒性以及心血管毒性等方面的應用進行論述。

1.2.1 斑馬魚在肝臟毒性研究中的應用

肝臟是重要的代謝器官，也是重要的解毒器官。目前，在藥物或者環境污染物毒性實驗中，仍然以大鼠、小鼠體內實驗和肝細胞體外實驗檢測藥物或污染物的肝臟毒性為主。但這些方法還存在一些局限性，例如細胞實驗不能準確反映藥物或污染物在體內微環境下的毒性或作用；嚙齒動物模型實驗費時、費力、費資金。近十年來，國內外的研究發現斑馬魚可用于構建多種人類疾病模型并用于藥物或污染物的肝臟毒性研究，而且斑馬魚及其胚胎在肝臟毒性方面的研究也更加符合國際上倡導的毒理實驗3R（Replacement，Reduction and Refinement）原則［9］。

Zhang等［10］通過雙向凝膠電泳及質譜分析方法，探討了慢性PFNA暴露斑馬魚成魚后，肝臟內蛋白譜表達的變化情況，鑒定了57個可能與PFNA肝臟毒性效應相關的差異表達蛋白，主要涉及物質代謝與能量代謝、蛋白質降解與修飾、氧化應激和細胞周期調控等。進一步研究部分差異表達蛋白的mRNA轉錄水平變化，發現蛋白翻譯水平變化與mRNA轉錄水平變化并不完全一致，提示了PFNA暴露后，生物體可能存在著復雜的基因轉錄調控與翻譯調控機制。Zhang等［11］采用PFNA流水式暴露斑馬魚180 d的研究方法，評估了PFNA在斑馬魚肝臟的累積水平和肝臟毒性效應。結果發現慢性PFNA暴露導致雌、雄斑馬魚肝臟內總膽固醇（Total cholesterol，TCHO）的含量升高；而甘油三酯（triglyceride，TG）的含量在雌、雄魚之間存在明顯的性別差異，即雄魚升高而雌魚下降的現象。這一發現與一些暴露于全氟烷酸類化合物（perfluoroalkyl acids，PFAAs）的職業工人血清膽固醇結果類似，即PFOS和PFOA與膽固醇含量之間有正相關關系［12］。這些結果暗示，斑馬魚可能是一個更合適研究PFAAs影響膽固醇的模式動物。同樣在基因表達水平變化的檢測也發現慢性PFNA暴露后，脂肪酸結合蛋白（fatty acidbinding proteins，FABPs）及其上游調控基因過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs）和CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT-enhancer-binding proteins，C/EBPs）的轉錄水平與各自對照組相比，在雄魚中顯著升高，而在雌魚中則顯著下降。有研究指出，PFAAs暴露所引起的基因表達的性別間差異可能來源于其對PFAAs的清除速率不同［13］。這種雌雄個體清除速率的差異可能是由于腎臟中有機陰離子轉運蛋白的差異表達，這些差異可能產生于性別分化期［14］。

Liu等［15］在全氟十二碳羧酸（perfluorododecanoic acid，PFDoA）暴露斑馬魚成魚實驗中發現，PFDoA可以引起斑馬魚明顯的肝臟病理學損傷，導致超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等發生顯著變化，并最終導致肝臟脂質過氧化。在基因水平上，PFDoA處理顯著地改變肝臟中與線粒體脂肪酸代謝和抗氧化相關的基因的表達。能夠顯著性地抑制pparα，cpt1，ucp-2和bcl-2的轉錄表達。說明PFDoA能夠通過干擾肝臟線粒體中脂肪酸的代謝，進而干擾線粒體中能量產生途徑，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產生并影響抗氧化系統，最終引起肝臟氧化損傷。

1.2.2 斑馬魚及其胚胎在生殖內分泌干擾毒性研究中的應用

近年來，斑馬魚也成為研究生殖內分泌干擾毒性的模式動物之一。目前在環境中已經發現有900多種內分泌干擾物（endocrine-disrupting chemicals，EDCs），其中有超過200多種被認為具有雌激素效應［16］，所以近來有關環境污染物對斑馬魚生殖內分泌干擾毒性的研究也引起了廣泛地關注。Deng等［17］研究發現，三溴苯酚（tribromophenol，TBP）暴露斑馬魚120 d后，顯著降低了斑馬魚產卵量；Carnevali等［18］也發現，連續暴露鄰苯二甲酸酯（Di-（2-ethylhexyl）-phthalate，DEHP）3周后，顯著降低了斑馬魚的產卵量。

Wang等［19］開展了斑馬魚成魚暴露一種有機磷酸酯阻燃劑-磷酸三（2，3-二氯丙基）酯（tris（1，3-dichloro-2-propyl）phosphate，TDCPP）實驗，發現TDCPP可以從成魚傳遞給F1代，并顯著增加F1代幼魚體內的ROS含量，降低存活率，降低血清中甲狀腺素水平；F0代雌魚和F1胚胎或幼魚的T3也顯著下降。

Liu等［20］開展斑馬魚慢性暴露PFNA的實驗，結果發現暴露PFNA 180 d后，斑馬魚F0代和F1代成體魚血漿中的T3水平顯著升高，同時F0代成體斑馬魚甲狀腺濾泡的病理組織切片結構發生改變。肝臟中的甲狀腺激素結合蛋白（transthyretin，TTR）基因的表達量顯著上升，而F0代斑馬魚肝臟內的磷酸尿苷葡萄糖苷（基）轉移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UDPG）表達水平顯著受到抑制。PFNA的長期暴露表現出了明顯的甲狀腺干擾效應。

1.2.3 斑馬魚及其胚胎在心血管毒性研究中的應用

斑馬魚由于其在體外發育，并且胚胎透明，可以在顯微鏡下實時觀察心血管的生成，所以在心血管研究領域有著廣泛的應用。Gerger等［21］用斑馬魚成魚進行苯并芘（Benzo［a］pyrene）暴露實驗，發現成魚暴露后，耗氧量明顯增加，心率明顯下降，肝臟和心臟組織的cyp1a基因表達量也明顯升高，苯并芘對斑馬魚的心血管系統有明顯的毒性作用。Zhang等［22］在用菲（phenanthrene，Phe）暴露斑馬魚胚胎實驗中也發現菲能夠損傷斑馬魚的心血管系統，造成了心室水腫、心室內壁變大變薄、小腸纖維化等現像，而基質金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）可以緩解菲的毒性效應，進一步研究發現，這一毒性效應與TGF-β通路激活有關。

Liu等［6］利用斑馬魚胚胎進行PFNA暴露實驗，發現PFNA可導致斑馬魚胚胎發育遲緩，孵化率降低心室水腫和脊椎彎曲。另外，PFNA暴露可顯著增加幼魚體內的ROS的含量。并發現這一現象可能與lfabp和ucp2基因的表達顯著升高，sod1和mtnd1基因的表達水平顯著下降有關。

2 斑馬魚及其胚胎在環境監測與評價中的應用

2.1 在水體無機物重金屬離子監測中的應用

檢測環境中重金屬污染最常用的方法就是用斑馬魚及其胚胎進行毒理學實驗［23，24］。重金屬通常可以抑制酶的活性［24ˉ26］或者影響基因的表達［27ˉ28］。所以可以通過檢測斑馬魚成魚或者胚胎的酶活性或者生物標志物基因的表達來間接地反映水體環境中的重金屬污染。例如，Ling等［29］發現一些酶的活性，包括SOD、CAT和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的酶活性受Cd、Zn或者甲基對硫磷（methyl parathion）的暴露而變化。這三種酶可以作為環境中復合污染的生物標志物。Leite等［30］發現斑馬魚暴露Cu2+后，可導致炎癥反應，氧化壓力，并伴隨炎癥反應相關基因il-1β，tnf-α，cox-2和pge2基因表達的變化。Wang等［31］發現斑馬魚在Cu2+暴露后，嗅覺系統中與神經發生相關的一些miRNA的表達量，如let-7，miR-7a，miR-128和miR-138發生了顯著下調，這可能與Cu2+介導的神經發生毒性相關。這些表觀遺傳的改變也可以作為檢測重金屬污染的新型生物標志物。

2.2 在有機污染物監測中的應用

環境中除了無機重金屬污染之外，近年來，越來越多的研究發現環境中的有機污染物被頻繁檢出，并且這些有害有機污染物的對環境及人類健康的影響已經引起流行病學家和生態毒理學家的廣泛關注。常見的有機污染物如-多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等，可以干擾斑馬魚的內分泌系統，影響胚胎發育、損傷DNA并且導致氧化壓力［32，33］。這一類化合物不僅具有發育毒性［34］，而且也會影響心血管系統發育及其相關基因的表達［35］。

全氟烷酸類化合物（perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances，PFASs）是一種新型持久性有機污染物，在環境中廣泛檢出。最近研究顯示PFASs能通過食物鏈富集放大，因此，對人類及野生動物的健康具有潛在的威脅。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）和全氟辛磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）是最常見的兩種全氟烷酸類化合物，它們都能夠影響斑馬魚的胚胎發育［36］。Du等［37］研究發現，PFOS暴露斑馬魚成魚后，影響雌激素受體和甲狀腺受體活性，降低了睪酮水平，升高了雌二醇水平；同時研究還發現，PFOS能夠顯著增加甲狀腺發育相關基因hhex和pax8的表達，降低甾類生成相關酶的基因cyp17，cyp19a和cyp19b的表達，并呈現濃度（劑量）-效應關系，檢測這些基因的表達變化為環境監測提供一個可行的方法。

此外，斑馬魚在水體中殺蟲劑和抗生素等污染監測中也有著廣泛的應用。Huang等［38］研究發現斑馬魚的游泳行為與水體中一種殺蟲劑-溴氰菊酯（deltamethrin，DM）的濃度有相關性。水體中DM的濃度達到1%就能夠影響斑馬魚的游泳行為。在暴露的最初2h內，斑馬魚的游泳速度和深度會受到明顯的影響，這被認為是監測水質最重要的時期。此外，還發現斑馬魚極度活躍的時間和浮出水面的時間與DM暴露濃度均呈現指數相關關系，這兩個參數可以作為區分水體DM污染級別的重要指標。

2.3 在水體環境類雌激素監測中的應用

近年來，研究發現一些物質如PFNA、雙酚A（bisphenol A，BPA）等在體內實驗中表現出現雌激素效應［39］，這些物質在水體環境中可能是扮演一種雌激素的效應，被稱為“環境雌激素（xenoestrogens）”［40］。Urbatzka等［41］用含有11種環境雌激素的杜羅河（位于葡萄牙）河口的水暴露斑馬魚成魚21d后，并用17α-乙炔雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE2）作為陽性對照，篩選出star、17β-hsd1、cyp19a1候選基因可用于水體環境中類雌激素的監測。Notch等［42］以斑馬魚胚胎為模型進行環境雌激素的暴露研究，斑馬魚胚胎在0 hpf時即進行EE2的暴露，并在12、24、48、72和96 hpf取樣研究，發現在24 hpf時，卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG）的mRNA的表達水平就已經顯著升高，這一基因的表達變化可以作為雌激素暴露的生物指示物。

2.4 轉基因斑馬魚在環境監測與評價中的應用

盡管野生型斑馬魚及其胚胎已廣泛地應用于環境污染物的毒性監測，但是這種方法仍然有不足之處，例如，檢測靈敏度相對較低，以及實驗過程及結果統計計算相對繁瑣等。最近，隨著遺傳學技術的不斷發展，轉基因技術也日益成熟，轉基因斑馬魚也越來越多地應用于藥物篩選和環境毒物監測領域。近年來，隨著斑馬魚胚胎顯微注射技術的完善，轉基因斑馬魚技術也迅速發展，目前，已有很多種技術成功地應用于斑馬魚的轉基因研究。如GAL4/UAS轉錄激活系統［43］、Tol2轉座子系統［44］和ΦC31整合酶系統［45］等。

目前，應用于環境監測的轉基因斑馬魚主要有以下五種類型：芳香烴反應元件（aromatic hydrocarbon response element，AHRE）、親電反應元件（electrophile response element，EPRE）、金屬離子反應元件（metal response element，MRE）、雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）和維甲酸和類維生素A X反應元件（retinoic acid and retinoid x response elements， RAREs， RXREs）［46］。 Petersen等［47］構建了一種雌激素反應元件轉基因斑馬魚tg（cyp19a1b-GFP）用于環境中類雌激素的監測，在研究中，分別用5種不同的環境雌激素暴露轉基因斑馬魚胚胎96 h，結果發現，所有潛在的和弱的類雌激素都能夠檢測到。Chen等［48］構建了一種轉基因斑馬魚，在這種魚的體內，利用vtg1的啟動子調控報告基因EGFP的表達，直觀地檢測水環境中的雌激素污染。通過熒光顯微鏡直接觀察轉基因斑馬魚的綠色熒光，可以直接判斷水樣中是否有雌激素污染，為環境雌激素的監測提供了一種便捷的工具。

3 前景展望

斑馬魚是一個相對“年輕”的模式生物，但是在最近30年，它在脊椎動物發育生物學以及人類疾病研究方面發揮了重要的作用。作為一種模式動物，應用于生態毒理學研究及環境監測領域，具有節約費用，易于飼養，節約空間等諸多優點。尤其是在轉基因斑馬魚品系建立后，用于環境監測的優越性日益體現出來，轉基因斑馬魚用于環境監測比野生型斑馬魚更加快速、更加靈敏、更加方便，能夠反映不同污染類型。在不久的將來，轉基因斑馬魚將會成為環境和水質監測的“哨兵”生物。

近年來，組學（-omics）不斷興起，尤其轉錄組測序及蛋白質組學技術在生態毒理學領域應用也得到了迅速發展，這將更加有利于以斑馬魚為研究模型研究環境污染物對人類健康危害和生物標志物的篩選。隨著科學技術手段的不斷改進，將來會有更多的轉基因（反應元件）斑馬魚品系的建立，為活體監測多種微量環境污染物監測提供可能。各種帶有不同反應元件的轉基因斑馬魚卵可以像基因芯片一樣排列在微孔板中，可以準確地檢測出水環境中各種污染物的種類，并可以根據熒光強度來推算污染物的濃度。另外，轉基因斑馬魚的GFP元件可以替換成其他新型的元件，在污染物存在的情況下可以直接發光，而不需要在熒光顯微鏡下觀察，這樣也會大大增加轉基因斑馬魚在野外直接檢測水體環境污染物的便捷性，使得轉基因斑馬魚在環境監測中更好地發揮作用。

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Application of zebrafish（Danio rerio）in the fields of environmental ecotoxicology and environmentalmonitoring

LIU Hui1，2，DAIJia-yin1*
（1.Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology，Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China；2.Department of Laboratory Medicine，Bengbu Medical College，Bengbu，Anhui233030）

Zebrafish，a new type ofmodel animal，has been widely used in many fields of biological research because of its low cost，ability of external fertilization，high fecundity，allowance of embryo transplant，and ectogenesis.Recently，zebrafish and its embryos have been widely used in ecotoxicological studies and environmentalmonitoring.Furthermore，with thematuration of zebrafish transgenic techniques，a new era has come for environmental pollution monitoring.

Zebrafish（Danio rerio）；Ecotoxicology；Environmentalmonitoring；Transgene

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0529-06

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.017

2015-08-20

國家高技術研究發展計劃（863計劃：2013AA065203）資助。

劉輝，男，博士，研究方向：生物化學，分子生物學。

戴家銀，博士，研究方向：生態毒理學。Email：daijy@ioz.ac.cn