microRNAs作為結核分枝桿菌感染標志物的研究進展

張文慧，楊丹鳳，董浩，韓鵬，賈宇，張林波

(吉林農業大學，長春 130118)

?

microRNAs作為結核分枝桿菌感染標志物的研究進展

張文慧，楊丹鳳，董浩，韓鵬，賈宇，張林波*

(吉林農業大學，長春 130118)

微小RNA(microRNAs)是一類長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它參與基因轉錄后的表達調控，在免疫系統的調控和運行中具有重要作用。結核分枝桿菌是典型的胞內寄生菌，其感染能夠引起人畜共患結核病。從microRNAs與結核免疫機制的相關性以及在結核分枝桿菌感染過程中巨噬細胞、外周血單核細胞及血清中microRNAs表達譜變化等方面，進行綜述microRNAs作為結核分枝桿菌感染標志物的研究現狀，以期為動物結核病檢測提供理論參考。

微小RNA；結核分枝桿菌；標志物

結核分枝桿菌是典型的胞內菌，其感染可引起人獸共患的慢性傳染病-結核病，嚴重威脅人類和動物的健康[1]。人類結核病預防用藥以注射卡介苗(BCG) 為主，BCG是牛型結核分枝桿菌強毒株經13年傳代培養獲得的減毒株，但臨床應用驗證其免疫效果大約在接種10～15年后逐漸減弱，而且無法預防潛伏性結核感染[2]。目前我國牛結核病診斷主要應用PPD方法，但由于結核免疫機制的復雜性和多變性，以及結核分枝桿菌的人獸交叉感染性，極大的阻礙了結核病診斷的研究[3]。因此尋找穩定、有效的結核分枝桿菌感染標志物就顯得尤為重要。microRNAs是由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸左右的小RNA分子，它參與基因轉錄后的表達調控，在免疫系統的調控和運行中具有重要作用[4]。已有研究表明microRNAs與結核分枝桿菌感染的免疫機制密切相關，有望成為結核病早期診斷標志物。本文從microRNAs與結核免疫機制的相關性以及在結核分枝桿菌感染過程中巨噬細胞、外周血單核細胞及血清中microRNAs表達譜變化等方面進行綜述，以期為動物結核病檢測提供理論參考。

1 microRNAs與結核免疫機制的相關性

在感染過程中，結核桿菌首先要克服先天免疫系統的屏障，才能成功感染宿主生物體[5]，吞噬細胞中的巨噬細胞為先天免疫防御入侵的病原體提供第一道防線。巨噬細胞和結核桿菌對抗產生細胞因子，細胞因子繼而使肺部巨噬細胞超活化，結核病的炎癥反應恰是由巨噬細胞吞噬結核桿菌并召集其他免疫細胞參與戰斗而導致的[6]。microRNAs是哺乳動物免疫系統中關鍵的調節器，參與調節結核免疫反應相關基因的表達及控制巨噬細胞內的炎癥反應，在結核宿主病原反應中起重要作用[7-8]。Spinelli等[9]2013年發現結核病經過專業治療后microRNAs與結核宿主反應相關細胞因子IL-6的表達水平呈現相關性。Ma等[10]2014年發現在巨噬細胞中miR-124可以作為一種有效的免疫調節器，當用卡介苗感染RAW264.7巨噬細胞和鼠巨噬細胞后，miR-124能夠調節巨噬細胞中Toll樣受體的信號活性，通過靶向調節Toll樣受體信號家族的多種組分來調節結核桿菌觸發的炎癥反應。Liu等[11]2013年發現miR-582-5p通過下調轉錄因子FOXO1的表達來抑制單核細胞的凋亡，并在抗結核分枝桿菌的免疫應答中發揮重要的調節作用。Singh等[12]2013年發現了結核桿菌的新型宿主免疫逃避機制，在結核分枝桿菌菌株H37Rv感染樹突細胞和巨噬細胞后，miR-99b的表達量高度上調；用RNA拮抗劑抑制miR-99b的表達導致樹突細胞內細菌顯著減少；敲除樹突細胞中miR-99b后促炎性細胞因子如IL-6、IL-12和IL-1β顯著上調；抑制miR-99b能增強TNF-α和TNFRSF-4的產生。以上研究表明，microRNAs與結核免疫調節機制具有高度相關性，一些microRNAs可能通過調控免疫相關基因而參與結核的發病機制。

2 microRNAs與結核病診斷的相關性

疾病早期診斷是現代醫學的主要挑戰之一，其最大優勢為，能通過對疾病進行早期干預減少病原侵入而提高疾病的治愈率。選擇專業性強的標志物作為診斷依據在早期疾病診斷中至關重要。結核病的早期診斷對于結核的有效控制和治療都非常重要，因此可以利用某些生物標志物提高結核診斷質量[13]。已有研究表明，microRNAs由于免受內源性核糖核酸酶作用而在組織、血清和血漿中穩定存在，這些循環的microRNAs有潛力成為疾病診斷標志物及疾病治療的靶標[14]。

2.1 巨噬細胞內microRNAs表達譜變化 人類感染結核桿菌后會引起巨噬細胞內microRNAs表達譜的變化，與潛伏性結核病發病機理密切相關，能提高對潛伏性結核病的診斷和預測[15]。Liu等[16]2014年采用微陣列法分析卡介苗感染后巨噬細胞內microRNAs的表達譜變化，發現有10種表達量下調和8種表達量上調。2013年Furci等[17]采用TaqMan低密度序列分析法，確定毒力結核分枝桿菌H37Rv和化學滅活后無毒力的牛分枝桿菌卡介苗菌株(BCG)，感染人類原代單核巨噬細胞后microRNAs表達譜變化，發現感染殺傷性毒力菌時miR-155和miR-146a會出現標志性變化。2013年Das等[18]用微陣列分析法分析有毒的H37Rv和無毒的H37Ra結核分枝桿菌感染THP-1巨噬細胞后microRNAs表達譜變化，發現H37Rv和H37Ra感染后巨噬細胞中9種microRNAs (miR-30a, miR-30e, miR-155, miR-1275, miR-3665, miR-3178, miR-4484, miR-4668-5p和miR-4497)的表達譜發生改變。

2.2 外周血單核細胞microRNAs表達譜變化 結核病人microRNAs的表達量，大多數和炎癥反應相關，為了研究microRNAs在結核病中的作用，2011年Liu等[19]采用微陣列法分析了肺結核患者和健康人外周血單核細胞中microRNAs表達譜變化，并通過熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證，發現活動性肺結核患者與健康對照組相比有30種microRNAs的表達量改變，其中28種表達量上調和2種表達量下調；在活動性肺結核患者中miR-144*過表達，通過miR-144*轉染T細胞實驗發現其能通過調節細胞因子TNF-α、IFN-γ的產生和T細胞的增殖來調節抗結核的免疫應答反應。Wu等[20]2012年采用微陣列法檢測了結核菌素純蛋白衍生物(PPD)誘導后，人外周血單核細胞中microRNAs表達譜變化。然后通過qRT-PCR實驗對顯著活性的microRNAs進行驗證，發現PPD誘導后microRNA-155在健康對照組變化1.4倍，而在活動性結核病組變化3.7倍；microRNA-155*在健康對照組變化1.9倍，而在活動性結核病組變化4.6倍。2011年Wang等[21]采用微陣列法分析結核病人和健康對照組外周血單核細胞中microRNAs表達譜變化，發現與健康對照組相比，結核病人外周血單核細胞中miR-365和miR-424的表達量顯著變化；潛伏性結核病患者的 miR-130a*、 miR-493*、 miR-520d-3p和miR-661表達量升高，miR-296-5p表達量下降；活動性結核患者的miR-21*、miR-223、miR-302a、miR-424、miR-451和miR-486-5p表達量升高，miR-130b*表達量下降。

2.3 血清中microRNAs表達譜變化 自從Lawrie等[22]首次提出microRNAs在血清中能被可靠的檢測出來，其在疾病診斷中的作用越來越得到研究者的重視，因此血清microRNAs有望成為結核病診斷的潛在標志物[23-24]。2011年Yi等[25]用微陣列分析法檢測活動性結核病人及健康人血清中microRNAs的表達量，并用qRT-PCR進行驗證，在檢測的1223種microRNAs中有92種的表達量發生改變，其中有59種表達量下調，33種表達量上調； 其中表達量上調的miR-29a能夠敏感特異的區分結核病人與健康對照組。Qi等[26]2012年采用TaqMan低密度序列分析法(TLDA)對30例活動性結核病人、60例百日咳桿菌(BP)，水痘 - 帶狀皰疹病毒(VZV)和腸道病毒(EV)病人血清中microRNAs的表達譜進行了分析，發現肺結核病人與健康對照組相比有97種microRNAs的表達量發生改變，其中有90種表達量上調，7種表達量下調；用qRT-PCR方法驗證發現miR-361-5p，miR-889和miR-576-3p三種microRNAs因具有穩定的敏感性和特異性能夠用來區分肺結核病人、健康人、和其他微生物傳染病。Zhang等[27]2013年采用Solexa序列分析法發現肺結核病人與健康對照組相比血清中有91種microRNAs的表達量發生變化，用qRT-PCR驗證發現在肺結核病人、健康對照組及不同診斷組(肺炎、肺癌和慢性阻塞型肺炎)血清中六種 microRNAs(hsa-miR-378、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-1和hsa-miR-320b)顯著改變。Zhang等[28]2014年利用solexa測序法分析活動性結核病人、卡介苗免疫過的健康人和未注射過卡介苗的潛伏性結核感染者血清中microRNAs的表達譜變化，通過microRNA—基因網對表達譜變化的microRNAs進行目標預測，并分析感染路徑發現，microRNAs調節的宿主免疫反應可能是結核發病機理的一個主要因素，通過qRT-PCR驗證發現hsa-miR-196b和hsa-miR-376c可能是活動性結核病潛在的生物標記物。

3 小結

結核分枝桿菌的感染可引起人-獸共患結核病，結核病的快速診斷及治療是世界性的公共衛生問題。microRNAs是近年來發現的一類進化上相對比較保守，由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸左右的小RNA分子。上述大量研究表明，microRNAs與結核病感染的免疫機制密切相關，某些microRNAs能夠通過調節巨噬細胞活化信號通路中的組分，進而調節結核分枝桿菌感染所觸發的炎癥反應，在結核病的診斷中表現出很大的應用潛力。同時，巨噬細胞、外周血單核細胞、血清中microRNAs表達譜變化的研究表明，microRNAs調節的宿主免疫應答反應可能是結核發病的一個主要因素。這些研究為microRNAs作為結核分枝桿菌感染標志物的研究奠定了良好的基礎，通過研究期望能夠找到一種或幾種特定的microRNAs分子，通過其表達量的上調或下調預測結核分枝桿菌的感染狀況，進而為以早期診斷為核心理念的動物疾病分子診斷技術提供新思路，為動物結核病的早期檢測提供參考。

[1] Bermudez L E, Goodman J.Mycobacteriumtuberculosisinvades and replicates within type II alveolar cells. Infect Immun, 1996, 64: 1400-1406.

[2] 劉珊珊,韓文瑜,雷連成,等. 結核疫苗研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 2013, 47(3): 52-57.

[3] 王曲直,劉佩紅,沈素芳,等. 牛結核病診斷方法研究進展[J]. 中國獸醫雜志, 2015, 51(2): 56-59.

[4] Belver L, de Yébenes V G, Ramiro A R. MicroRNAs prevent the generation of autoreactive antibodies[J]. Immunity, 2010, 33(5): 713-722.

[5] Katalinic′-Jankovic′ V, Furci L, Cirillo D M. Microbiology ofMycobacteriumtuberculosisand a new diagnostic test for TB[J]. European Respiratory Monograph, 2012, 58: 8-13.

[6] Sompayrac L. How the immune system works[M]. John Wiley & Sons, 2012.

[7] Furci L, Schena E, Miotto P,etal. Alteration of human macrophages microRNA expression prole upon infection withMycobacteriumtuberculosis[J]. International journal of mycobacteriology, 2013, 2: 128-134.

[8] Furci L, Schena E, Miotto P,etal. MicroRNA induction in human macrophages associated with infection with ancient and modern TB strains[J]. International Journal of Mycobacteriology, 2015, 70: 1-10.

[9] Spinelli S V, Diaz A, D’Attilio L,etal. Altered microRNA expression levels in mononuclear cells of patients with pulmonary and pleural tuberculosis and their relation with components of the immune response[J]. Molecular immunology, 2013, 53(3): 265-269.

[10]Chunyan Ma, Yong L, Min Li,etal. microRNA-124 negatively regulates TLR signaling in alveolar macrophages in response to mycobacterial infection[J]. Molecular immunology, 2014, 62: 150-158.

[11]Yanhua L, Jing J, Xinjing w,etal. miR-582-5p is upregulated in patients with active tuberculosis and inhibits apoptosis of monocytes by targeting FOXO1. PloS one, 2013, 8(10 ): e78381.

[12]Singh Y, Kaul V, Mehra A,etal.Mycobacteriumtuberculosiscontrols microRNA-99b (miR-99b) expression in infected murine dendritic cells to modulate host immunity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(7): 5056-5061.

[13]Wallis R S, Pai M, Menzies D,etal. Biomarkers and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice[J]. The Lancet, 2010, 375(9729): 1920-1937.

[14]Singh P K, Singh A V, Chauhan D S. Current understanding on microRNAs and its regulation in response toMycobacterialinfections[J]. J Biomed Sci, 2013, 20(14): 1-9.

[15]Meng Q L, Liu F, Yang X Y,etal. Identification of latent tuberculosis infection-related microRNAs in human U937 macrophages expressingMycobacteriumtuberculosisHsp16.3[J]. BMC microbiology, 2014, 14(37): 1-9.

[16]Zhen Liu, Guoyong Zhou, Xiangdong Deng,etal. Analysis of miRNA expression profiling in human macrophages responding toMycobacteriuminfection: Induction of the immune regulator miR-146a[J]. Journal of Infection, 2014, 68: 553-561.

[17]Furci L, Schena E, Miotto P,etal. Alteration of human macrophages microRNA expression profile upon infection withMycobacteriumtuberculosis[J]. International Journal of Mycobacteriology, 2013, 2(3): 128-134.

[18]Das K, Saikolappan S, Dhandayuthapani S. Differential expression of miRNAs by macrophages infected with virulent and avirulent Mycobacterium tuberculosis[J]. Tuberculosis, 2013, 93: S47-S50.

[19]Liu Yanhua, Wang Xingjing, Jiang Jing,etal. Modulation of T cell cytokine production by miR-144*with elevated expression in patients with pulmonary tuberculosis[J]. Molecular immunology, 2011, 48(9): 1084-1090.

[20]Wu Jing, Lu Chanyi, Diao Ni,etal. Analysis of microRNA expression profiling identifies miR-155 and miR-155*as potential diagnostic markers for active tuberculosis: a preliminary study[J]. Human immunology, 2012, 73(1): 31-37.

[21]Wang Chuan, Yang Shunyao, Sun Gang,etal. Comparative miRNA expression profiles in individuals with latent and active tuberculosis[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e25832.

[22]Lawrie C H. MicroRNAs and haematology: small molecules, big function[J]. British journal of haematology, 2007, 137(6): 503-512.

[23]Cortez M A, Bueso-Ramos C, Ferdin J,etal. MicroRNAs in body fluids the mix of hormones and biomarkers[J]. Nature reviews. Clinical oncology, 2011, 8(8): 467-477.

[24]Xu Z, Zhou A, Ni J,etal. Differential expression of miRNAs and their relation to active tuberculosis[J]. Tuberculosis, 2015, 3(10): 1-9.

[25]Fu Yurong, Yi Zhengjun, Wu Xiaoyan,etal. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. Journal of clinical microbiology, 2011, 49(12):4246-4251.

[26]Qi Y, Cui L, Ge Y,etal. Altered serum microRNAs as biomarkers for the early diagnosis of pulmonary tuberculosis infection[J]. BMC infectious diseases, 2012, 12 (384):1-9.

[27]Zhang X, Guo J, Fan S,etal. Screening and identification of six serum microRNAs as novel potential combination biomarkers for pulmonary tuberculosis diagnosis[J]. PloS one, 2013, 8(12): e81076.

[28]Zhang H, Sun Z, Wei W,etal. Identification of serum microRNA biomarkers for tuberculosis using RNA-seq[J]. PloS one, 2014, 9(2): e88909.

(編輯：陳希)

Progress in MicroRNAs as Infective Biomarkers of Infection ofMycobacteriumtuberculosis

ZHANG Wen-hui, YANG Dan-feng, DONG Hao, HAN Peng, JIA Yu, ZHANG Lin-bo*

(JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

MicroRNA is a kind of non-coding single stranded RNA molecules formed by about 22 nucleotides. It involved in regulation after gene transcription and plays an important role in the regulation and operation of the immune system.Mycobacteriumtuberculosisis the typical parasitic bacterium in the cell, and its infection can cause zoonosis. It is reviewed in this article that the progress in microRNAs as infective biomarkers of infection ofMycobacteriumtuberculosisfrom the correlation of microRNAs with tuberculosis immune mechanism and microRNAs expression changes in macrophages, mononuclear cells and serum in the process of infection ofMycobacteriumtuberculosis, which may provide the theoretical reference for the detection of animal tuberculosis.

microRNA;Mycobacteriumtuberculosis; biomarker; progress

吉林省科技發展計劃資助項目(20130101105JC，20140204018YY)

張文慧，副教授，從事病原微生物與免疫學研究；楊丹鳳，碩士，從事病原微生物研究,與張文慧為并列第一作者。

張林波。E-mail:cczlb@126.com

2015-07-21

A

1002-1280 (2015) 10-0062-04

Q939.93