Notch1在心血管疾病中的研究現狀

Notch1在心血管疾病中的研究現狀

馬建贏唐燕華

(南昌大學第二附屬醫院心胸外科，江西南昌333000)

關鍵詞〔〕Notch1；動脈粥樣硬化；先天性心臟病；心臟干細胞

中圖分類號〔〕R541〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81160019)

通訊作者：唐燕華(1965-)，女，主任醫師，博士生導師，主要從事心臟病研究。

第一作者：馬建贏(1986-)，男，碩士，主要從事先天性心臟病與基因關系的研究。

心臟發育是一個極其復雜的過程，需要各種信號通路調節基因時間和空間的精確表達，常見的與心臟發育相關的信號通路包括骨形態發生蛋白(BMP)，Wnt /Wingless，轉化生長因子(TGF)及Notch信號通路等。國內外實驗研究提示Notch信號介導的細胞間通訊在心血管發育過程中起著非常關鍵的作用，而對于Notch同源分子之一的Notch1研究較少，現就 Notch1在心血管疾病研究現狀進行綜述。

1Notch信號通路

1.1Notch信號通路的組成1917年，Morgan及其同事在突變的果蠅中發現一種基因，該基因的部分功能缺失會使果蠅翅膀邊緣出現缺刻，隨后研究發現Notch在脊椎動物中也有表達，并在細胞分化、發育中起著關鍵作用。

1.2Notch信號通路的生化機制Notch信號轉導不需要第二信使和蛋白激酶的參與，可直接接收鄰近細胞的信號并傳到細胞核，激活相關轉錄因子的表達。配體與受體的結合導致受體產生兩次蛋白裂解是Notch信號通路的主要機制。第一次蛋白裂解由金屬蛋白酶(ADAM)家族成員之一的腫瘤壞死因子α轉化酶介導〔1〕，第二次裂解由包括早老素在內的蛋白分泌酶復合體來完成。經過上訴酶切過程，形成了可溶性的Notch胞內段的活化形式(NICD)并轉移到核內與初級轉錄因子CSL結合〔2，3〕。NICD與CSL結合并募集共活化物，如MAml和維生素D受體共激活因子ski相互作用蛋白(SKIP)，MAml動員組蛋白乙酰基轉移酶P300并誘導轉錄起始和延伸復合物的裝合物的裝配。缺乏Notch信號通路，CSL則與共抑制受體SMRT、MINT/SPEN、CtBP、組蛋白去乙酰化酶結合后抑制Notch靶基因的啟動，最終影響細胞的分化、增殖和凋亡〔4，5〕。除了CSL經典通路外，最近有發現非CSL依賴的Notch信號通路，它涉及到絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性蛋白激酶(AKT)的激活，轉錄因子Stat3的磷酰化，Sonic和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的激活，具體機制尚不清楚〔6〕。Notch信號轉導通路的調節是多層面的，包括配體-受體的表達，配體受體的相互作用和運輸以及共價性修飾(糖基化、磷酸化和泛素化)，部分泛素化途徑的Notch蛋白質具有保守性的區域，并且Notch胞內結構域的泛素最近被發現是可以降解的，Notch途徑的蛋白水解的異型衍生物也確定可能涉及到替代性的Notch途徑或者調節機制〔7〕。

2Notch1與心血管疾病的關系

2.1Notch1與瓣膜疾病的關系上皮間質轉化(EMT)是胚胎發育的基礎，所謂EMT就是緊密的上皮細胞失去之前的細胞形態，形成一種新的間質細胞類型。心臟瓣膜的形成恰好是EMT轉化的一個比較好的例子，它也是心臟瓣膜發育的一個必經過程。心臟瓣膜位于房室管和流出道的組織，在房室管的EMT發育成二尖瓣和三尖瓣，在流出道的EMT則發育成主動脈瓣和肺動脈瓣膜。心臟瓣膜的形成是多種因素共同調節形成的，比如Wnt、骨形態發生蛋白(Bmp)、Notch等，目前普遍認為Notch、Wnt 和Bmp都參與EMT過程。Wang等〔8〕發現Notch1-jagged1信號通路在小鼠心臟EMT以及早期心臟瓣膜形成過程中起到決定性的作用，從分子水平上證實敲除Notch1或jagged1的小鼠胚胎引發EMT形成中關鍵性基因的表達減少，包括轉錄因子Hey1、Snai1、Snai2、Msx1和Msx2，同時在一定程度上證明了Notch，Wnt 和Bmp 信號通路相互關聯性的參與EMT過程。綜上可推測Notch1的突變將影響EMT的形成從而引起瓣膜疾病。主動脈瓣疾病是一個比較常見的瓣膜病變，鈣化瓣膜可導致狹窄或者反流。Acharya等〔9〕研究證實在人的鈣化主動脈瓣膜中激活的Notch1明顯減少，這個鈣化的過程伴隨著EMT的裂解。至于突變Notch1導致主動脈瓣鈣化的原因，有很多機制，Acharya等〔9〕認為Notch1突變引起Sox9表達的下調，Sox9是一種可以調節EMT基因表達的關鍵性轉錄因子，同時它亦是正常瓣膜形成所必須的，Sox9表達的下調導致主動脈瓣鈣化的發生。Zeng等〔10〕發現Notch1水平的升高和不斷激活可以調節細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)、核轉錄因子kappa B(NF-κB)的活性從而造成主動脈瓣間質細胞的鈣化反應。總之Notch1導致瓣膜病變的機制尚待進一步研究。

2.2Notch1與動脈粥樣硬化(AS)的關系AS是一種炎癥性疾病，是具有慢性炎癥反應特征的病理過程。這種炎癥過程源于血漿脂蛋白、細胞組分(單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、內皮細胞和平滑肌細胞)與動脈壁細胞外基質間的相互作用。病理變化主要累及體循環系統的大型肌彈力型動脈(如主動脈)和中型肌彈力型動脈(以冠狀動脈和腦動脈)。巨噬細胞在 AS起始發展的全過程中扮演著重要角色。巨噬細胞脂質化后形成泡沫細胞是粥樣硬化發生的始動因素。但是巨噬細胞中Notch1信號通路調控介導AS發生、發展的機制仍然不是十分明確。Notch1在巨噬細胞分化過程中可以促進M1型巨噬細胞的激活和細胞因子的釋放引起炎癥反應，導致AS，干擾Notch1信號通路則可明顯促進抗炎癥型M2型巨噬細胞的產生以及上調抗炎癥細胞因子的分泌〔11〕。血管內皮細胞也是Notch1信號通路作用的一個靶點，Liu等〔12〕發現Notch1可抑制內皮細胞的生長引起內皮細胞衰亡，而且notch1信號通路可以正反饋調節內皮細胞炎癥因子的表達，如白細胞介素6(IL-6)，IL-8，IL-1α，細胞間黏附分子-1(ICAM-1)等，這些機制最終都潛在性參與了AS的發生、發展。此外，淋巴細胞也被發現與AS的發生密切相關。T細胞的活化需要輸入信號和外部信號的整合，二者通過T細胞表面受體介導的NF-κB來形成CBM(由支架蛋白CARMA1、銜接蛋白BCL10和Paracaspase酶MALT1組成)復合物。細胞質中的Notch1在早期通過激活NF-κB起到分子支架的作用，晚期則促進NF-κB基因的轉錄，故notch1對于T細胞的活化起到重要的作用〔13〕。Del Papa等〔14〕發現體外實驗中CD4+T細胞與間充質干細胞(MSCs)同時培養時Notch1通路是活化狀態的，通過γ分泌酶抑制劑(GSI-I)或者 Notch1中和抗體來抑制Notch1信號通路，則Notch1信號下游的靶基因表達MSC誘導的CD4+CD25FOXP3+細胞百分比減少，實驗還表明FOXP3是Notch1信號通路下游的靶基因，并提示notch1信號通路的激活是人類MSC介導的調節性T細胞形成的新型機制。調節性T細胞具有兩種特征即免疫抑制性及免疫無反應性，它通過以下兩個方面來抑制炎癥反應延緩AS：(1)調節性T細胞可以促進M1型巨噬細胞向抗炎性M2型巨噬細胞轉化。(2)調節性T細胞可以下調清道夫受體 SR-A 和 CD36來抑制脂質的沉積，最終阻礙巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，而泡沫細胞的形成是AS最具有特征性的事件〔15〕。Notch1除了誘導產生調節性T細胞抑制AS的進展，它同期誘導產生的T細胞可以促進或者加重AS。 Zhou等〔16〕將有免疫缺陷的和有AS傾向的載脂蛋白E(Apoe-/-)小鼠進行雜交，其后代動脈脂肪紋損害的程度較正常免疫的小鼠下降73%，將CD4+T淋巴細胞從Apoe-/-轉移到有免疫缺陷的Apoe-/-損傷增加164%，說明CD4+T淋巴細胞能促進AS的形成。表達 CD41Th2的白變種實驗室老鼠(BALB/c)老鼠不易發生AS，而表達CD41Th1的老鼠傾向于發生AS，給予這兩種老鼠喂養高膽固醇飼料16 w后發現，通過抗體a-CD4或IL-4來減少Th1 cells可以使AS損害下降了80%，而Th2剔除的BALB/c 老鼠與CD41Th1老鼠發生AS的概率相當，這提示Th2對于AS的發生發展或許作用更大〔17〕。綜上所述，Notch1對于T細胞分化的調控最終可能導致AS的發生，若發生在冠狀動脈，則可引起冠心病，若發生在外周動脈，則可能引起高血壓等心血管疾病。

2.3Notch1與先天性心臟病(CHD)的關系

2.3.1CHD是指胚胎時心血管發育異常所致的心臟血管形態、結構、功能、代謝的異常。它的發病率高，危害性大，也是嬰幼兒死亡的主要原因。到目前為止CHD的病因仍然不是十分明確，但是認為它是由環境和遺傳兩個關鍵因素造成的。環境因素主要為母親妊娠期疾病，宮內感染及服用藥物和高溫、輻射暴露等因素。遺傳因素包括單基因、多基因、染色體等。由染色體畸形導致的疾病包括21三體綜合征、貓叫綜合征等，引起先天性心臟病的單基因有GATA4、NKX2-5、TBX5、notch。

2.3.2Notch1與CHD研究表明，在小鼠胚胎8.5 w，靠近心內膜的心肌細胞更多的表達Notch1，而遠離心內膜的組織較少表達Notch1。胚胎9.5 w，心房心內膜表達Notch1，心室肌骨小梁在發育過程中不對稱性表達Notch1，到11.5 w時，左、右心室的骨小梁高度表達Notch1，13.5 w時心房壁開始表達Notch1〔18〕。Notch1對于心臟心室腔和骨小梁生長十分關鍵。骨小梁逐漸發展為室間隔、心臟傳導組織以及乳突肌的一部分。任何影響骨小梁的因素都最終可能導致先天性心臟病。Grego-Bessa等〔19〕發現Notch1和RBPJk的突變導致骨小梁形成受損，減弱Eph受體相互作用蛋白B2(EphrinB2)，NRG1(Neuregulin-1)和BMP10的表達以及抑制心肌的增長，并且認為在骨小梁的分化中Notch1獨立的調節心肌心包的增長和分化，這其中主要包括兩個過程，其一是原始心肌內皮細胞向骨小梁和致密心肌的轉化，另外一個是在上述轉化過程中增值性骨小梁心肌細胞數目的保持。Notch1調節過程的紊亂都可以導致先天性心臟病的發生。

先天性主動脈瓣狹窄、主動脈縮窄和左心室發育不良綜合征都是與左室流出道有關的先天性畸形。McBride等〔20〕發現在左室流出道缺陷的病人中發現了Notch1突變，而且Notch1突變減少了Notch信號通路中配體jagged1的數量以及干擾Notch配體S1的分裂，其中的分子機制以及相關信號通路如何導致左室流出道的缺陷仍然不清楚。心臟右心室流出道形成中，血管內皮生長因子和Notch的作用逐漸被認可，van den Akker等〔21〕用免疫組化的方法發現胚胎老鼠心臟右心室流出道的異常突變的血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2)，Notch1以及Jagged2，并推測它們的異常會導致心內膜墊和心肌的缺陷，并最終可導致CHD，比如法洛四聯癥。

2.3.3Notch1與心律失常的關系心臟正常激動起源于竇房結，沿著傳導系統下傳，依次傳入心房和心室，使心臟發生收縮和舒張反應。如果竇房結激動異常或激動起源于竇房結以外，激動的傳導緩慢、阻滯或經異常通道傳導，就會產生心律失常。至于心律失常的機制有很多，目前普遍認為離子通道和離子通道調控蛋白突變是心律失常的主要病因，包括長QT綜合征、Brugada綜合征(BS)、兒茶酚胺誘導的多形室性心動過速，心房顫動。已有多個離子通道基因被證明與心律失常的形成相關，包括SCN5A、KCNQ1、KCNE1、KC-NE2、HERG、KCNJ2等。Rentschler等〔22〕研究發現小鼠心肌生長過程中表達活化形式的Notch1 則會產生心室預激，心肌激活的Notch信號可以產生滲透性的附加徑路和心室預激。相反，抑制心肌Notch信號可使房室結發育不良，即特異性喪失表達連接蛋白30.2的慢傳導細胞(Cx30.2)和生理性房室傳導延遲的喪失，結果表明在心肌傳導組織形成過程中，Notch調節AV通路胚胎心肌細胞的功能性成熟。隨著研究的深入，越來越多的基因被發現，機制也將進一步被闡明，將為指導臨床診斷和治療提供更好的線索〔22〕。

2.3.4Notch1與心肌病的關系除了上述心血管疾病與Notch1存在一定的關聯外，目前還發現了Notch1與心肌病有一定關系。心臟干細胞(CSCs)是一種自我更新的多功能細胞，可以分化為心肌細胞、平滑肌細胞或者內皮細胞。Notch1信號通路對于CSCs的生長以及分化非常重要。CSCs表達Notch1配體以及位于細胞核內活化形式的Notch片段(N1ICD)，N1ICD的過度表達可以顯著擴增肌細胞的數目。在新生小鼠體內使用 γ-secretase 抑制劑阻斷Notch通路，增加了擴張性心肌病的發生率以及高死亡率〔23〕。 Collesi等〔24〕發現體內或體外實驗的未成熟心肌在增生過程中都表達Notch1，而且激活的Notch1在心臟的數量隨著時間會逐漸減少，抑制Notch通路會妨礙心肌的增生并引起心肌壞死。也有一些研究認為Notch1與肥厚性心肌病有聯系，但是仍缺乏足夠的證據，有待進一步研究。

3結語和展望

Notch1與心血管疾病關系密切，而且逐漸成為國內外的研究熱點，比如最近有報道降主動脈夾層瘤患者的血管中層平滑肌組織標本中Notch1以及其配體Delta-like 1顯著減少，并提示Notch信號通路在降主動脈夾層動脈瘤中作用復雜〔25〕。目前就Notch信號通路來說，其配體、受體以及下游靶基因類型較多，且相關配體受體的功能不十分清楚，通路的組成成分復雜多樣，而且Notch1信號通路可以與Wnt信號/ B連環蛋白通路、TGF-β/Smads信號轉導通路構成網絡橋參與心血管疾病，故需大量的實驗去研究Notch1信號通路，對Notch1在心血管方面的機制有更清楚的認識，才能針對性的指導臨床治療。

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〔2015-04-17修回〕

(編輯袁左鳴)