高產Monacolin K紅曲霉菌種的篩選及液態發酵條件優化

陳 泉，吳遠征，扈進冬，王貽蓮，趙曉燕，趙吉興，李 耀，李紀順

（1.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南250014；2.山東中惠生物科技股份有限公司，山東惠民251706）

高產Monacolin K紅曲霉菌種的篩選及液態發酵條件優化

陳 泉1，吳遠征1，扈進冬1，王貽蓮1，趙曉燕1，趙吉興2，李 耀2，李紀順1*

（1.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南250014；2.山東中惠生物科技股份有限公司，山東惠民251706）

為了提高紅曲霉（Monascus）液態發酵生產Monacolin K的能力，一種新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術被應用于產Monacolin K紅曲霉菌株的誘變選育工作；同時，通過構巢曲霉（Aspergillus nidulans）平板對峙培養的篩選方法，選育獲得較初始紅曲霉菌Monacolin K產量提高60%以上的突變菌株MP60-6。確定發酵培養基組成為甘油5%，米粉50 g/L，蛋白胨15 g/L，NaNO32 g/L，MgSO41 g/L，ZnSO42 g/L，KH2PO41.5 g/L，并進一步確定在發酵第3、第4天添加0.1%的乙酸和0.2%的檸檬酸，發酵第8天補加10%的甘油。在上述條件下發酵17 d后Monacolin K產量可以達到1 302 mg/L，為出發菌株產量的2.66倍。

Monacolin K；紅曲霉；誘變；液態發酵

Monacolin K是最早由日本學者遠騰章在紅色紅曲霉中發現的一種膽固醇合成抑制劑[1]，其商品名為洛伐他?。↙ovastatin），是一種新型的調整血脂藥，深受廣大患者的歡迎。Monacolin K具有酸型和內酯型兩種存在形式，研究發現，真正起降脂作用的是酸型Monacolin K。內酯型的Monacolin K本身無活性，需要人體內羥基水解酶水解后才能發揮降脂功效，從而增加肝腎負擔。天然發酵的紅曲霉產生的主要是酸型洛伐他汀，并且其發酵產物中除了含有Monacolin K之外，還有一系列Monacolin結構類似物、不飽和脂肪酸等生理活性物質存在，不僅具有協同調節血脂的功效，而且極大地降低了純品Monacolin K的副作用[2-3]。因此，以紅曲霉開發的保健食品、藥品在國內、國際市場上都非常受歡迎。

目前紅曲霉生產洛伐他汀主要采用固態發酵的方式。固態發酵具有生產過程簡單、投資少、產量高、后處理簡單等優點，但固態發酵周期較液態發酵長、條件不易控制、容易染菌等。在工業化固態發酵時，培養基和培養條件對其產量和品質的影響很大，獲得的產品品質參差不齊，已逐漸失去市場競爭力。液態發酵法具有規模大，自動化程度高，人力成本低，生產過程易控制等顯著優點[4-5]。但是，由于受到產量和生產成本的限制，液態發酵生產Monacolin K的研究一直停留在實驗室水平，沒有形成產業化規模[6]。因此，提高紅曲霉液體發酵產生Monacolin K的產量成為目前亟待解決的問題。

優良菌種的選育是提高紅曲霉中Monacolin K產量的一個較為切實可行的方法。在紅曲霉菌株誘變中常用的方法包括紫外誘變、氯化鋰誘變、超高壓誘變、亞硝酸和硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）誘變以及多種方法聯用的復合誘變[7-10]。隨著誘變技術的進步，很多新興的誘變方法也被逐漸用于紅曲霉菌株的選育，比如離子束誘變[11]、激光誘變和空間誘變等[12-13]。

另外，改良紅曲霉發酵培養基的成分，尤其是研究發酵工藝中作為添加劑的碳源、氮源、無機鹽等因素對紅曲霉發酵生產Monacolin K的影響，也是目前研究的重點和熱點。目前已報道的可有效促進紅曲霉合成洛伐他汀的添加劑包括：碳源有甘油、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、乙醇、乙酸；氮源有蛋白胨、玉米漿、大豆粉、NaNO3；無機鹽有MgSO4、ZnSO4[14-17]。

篩選適用于液態發酵的紅曲霉Monacolin K高產菌株并優化其發酵條件，是解決當前Monacolin K液態發酵產量不高的最直接也是最行之有效的方法，對于國內紅曲產業的發展具有一定的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）ZH01：山東中惠食品有限公司。

1.1.2 培養基

種子培養基：米粉30 g，葡萄糖20 g，NaNO32 g，蛋白胨15g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO41.5g，加水至1000mL，pH自然。

發酵培養基：米粉50 g，甘油50 mL，NaNO32 g，蛋白胨15 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO42 g，KH2PO41.5 g，加水至1 000 mL，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加水至1 000 mL，pH自然。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、甘油、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、ZnSO4、CaCl2、NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3等化學試劑均為國產分析純，大豆蛋白粉、酵母粉、豆粕粉和牛肉膏等均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種系統：無錫思源清生物科技有限公司；Agilent 1260 Infinity四元液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；HZQ-Q全溫振蕩器、HPS-250生化培養箱：北京東聯哈爾有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液體培養方法

從PDA平板上刮取紅曲霉菌落接種到種子培養基中，30℃條件下搖床培養3 d，按照15%的接種量轉接到發酵培養基，26℃條件下培養14～21 d。

1.3.2 紅曲霉誘變方法

（1）單孢子懸液的制備

以生理鹽水將孢子從平板或斜面上洗下，制得孢子懸液，接種到小米培養基（8 g小米+10 mL水）中，培養48 h左右，加入生理鹽水制得菌懸液以無菌紗布過濾，以玻璃珠振蕩打散至單孢子懸液，備用。

（2）ARTP等離子流誘變

以時間為可變參數，功率和氣量為固定參數（功率為100 W，氣量為10 L/min）。首先，打開紫外燈對操作倉消毒30 min。同時，在超凈臺中取待誘變孢子懸液10 μL均勻涂于載片上，打開無菌風吹干；將裝有樣品載片的平板移至ARTP操作倉，用無菌鑷子將載片放于對應孔位，調節載臺下方旋鈕，使載片位于氣流出口2 mm處，并關閉倉門；設置處理時間，點擊“開始”按鈕處理樣品；樣品處理完畢，用無菌鑷子將載片放入裝有1 mL生理鹽水的離心管中，將離心管振蕩1 min洗脫載片上的菌液；對得到的菌懸液適當稀釋后涂布PDA平板，28℃培養72 h。

1.3.3 洛伐他汀高產紅曲霉菌株的初篩

構巢曲霉對峙培養法：使用平皿打孔器移取相同大小的待篩選紅曲霉菌落接種到PDA平板的一側，28℃培養5 d后，在平板另一側對應位置接種相同大小的構巢曲霉菌落，將平板放于26℃培養箱中進行靜置培養7 d后，測量構巢曲霉的菌落直徑。

1.3.4 洛伐他汀的檢測方法

發酵液樣品處理：取250 μL發酵液與750 μL甲醇一起加到1.5mL的離心管中，超聲波振蕩處理60min，經0.22μm的薄膜過濾后，樣品中的洛伐他汀含量進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。

HPLC檢測條件：色譜柱250 mm×4.6 mm C18柱；紫外檢測器；檢測波長238 nm；流動相：甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；流速1 mL/min；進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 對峙培養實驗中構巢曲霉菌落直徑與紅曲霉合成洛伐他汀能力的關系

紅曲霉產生的洛伐他汀對構巢曲霉的生長具有一定的抑制作用。因此，將紅曲霉與構巢曲霉進行對峙培養，從理論上來說，紅曲霉合成Monacolin K的能力越強，其對應的構巢曲霉的菌落直徑就越小。為了驗證這一推論，隨機挑取ARTP等離子體誘變得到的誘變株與構巢曲霉進行對峙培養，同時將這些誘變株進行液體搖瓶培養14 d，利用HPLC檢測其Monacolin K的產量，從而分析在對峙培養實驗中構巢曲霉菌落直徑與紅曲霉合成Monacolin K能力的關系，結果如圖1所示。

由圖1可知，隨著構巢曲霉菌落直徑的增大，其對應紅曲霉Monacolin K的產量出現逐漸減少的趨勢。因此，構巢曲霉的菌落直徑可以作為衡量對峙培養的紅曲霉合成Monacolin K能力的一個指標。采用構巢曲霉對峙培養實驗對產MonacolinK紅曲霉進行初篩具有通量高，準確性相對較高的優點。

2.2 誘變菌株的遺傳穩定性

通過構巢曲霉對峙培養初篩以及液體搖瓶培養后HPLC檢測復篩，共得到4株（MP60-3、MP60-6、MP45-1、MP45-11）Monacolin K產量較出發菌株有明顯提高的誘變株。相對于出發菌株489.34 mg/L的Monacolin K產量，篩選得到的這4株菌Monacolin K的產量提高了1.4～1.7倍不等。為了驗證得到的4株菌產生Monacolin K的遺傳穩定性，將這4株紅曲霉菌株傳代5代，分別檢測其洛伐他汀產量的變化，結果如表1所示。

由表1可知，MP60-3、MP45-1和MP45-11的Monacolin K產量從第3代開始迅速下降，經五代培養后其產量都有大幅減低，不具有工業化大生產的優越性。菌株MP60-6的Monacolin K產量較穩定，說明其遺傳性狀穩定，具有應用于工業化大生產的潛力，成為進一步的研究對象。

2.3 最佳碳源的選擇

碳源是發酵培養基中最重要的成分之一，對微生物生長代謝的作用主要為提供細胞的碳架，提供細胞生命活動所需的能量，提供合成產物的碳架。紅曲霉的液體發酵一般需要速效碳源和遲效碳源兩種。培養基中的速效碳源在發酵的前期，對紅曲霉的快速生長繁殖有最直接的影響。為確定紅曲霉MP60-6生產Monacolin K的最佳速效碳源，比較了其分別利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油和木糖，初始濃度均為5%發酵Monacolin K的產量，結果見圖2。由圖2可知，在選定的5種速效碳源中，甘油為速效碳源時發酵液Monacolin K最高可達1 011 mg/L，明顯優于其他速效碳源。此外甘油來源豐富、組成簡單、價格便宜，故選定甘油為最佳速效碳源，而其遲效碳源通常都是使用大米粉，其有利于紅曲霉生長后期次級代謝產物的形成。故采用5%甘油+50 g/L米粉作為紅曲霉發酵的初始碳源。

2.4 最佳氮源的選擇

氮源是構成菌體細胞中核酸、蛋白質和細胞質的主要成分，也是合成各種含氮代謝產物的重要原料，對微生物的生長和目標產物的積累有重要的影響。培養基中使用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。在培養基中合理地加入不同氮源，有利于縮短紅曲霉生長時間，提高Monacolin K的產量。實驗比較的有機氮源包括酵母粉、大豆蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨和豆粕粉，其初始濃度均為15g/L，無機氮源包括NH4Cl、（NH4）2SO4、NH4NO3和NaNO3，其初始濃度均為2g/L。不同氮源對紅曲霉MP60-6產Monacolin K的影響結果見圖3。

由圖3可知，有機氮源中蛋白胨發酵Monacolin K產量最高，無機氮源中NaNO3發酵Monacolin K產量最高。故發酵培養基中分別選用15 g/L蛋白胨和2 g/L NaNO3分別作為有機和無機氮源。

2.5 無機鹽對紅曲霉產Monacolin K的影響

培養基中的無機鹽在微生物生長和代謝產物合成中也具有舉足輕重的作用。本實驗比較了不同質量濃度（1 g/L、2 g/L、4 g/L）的MgSO4、ZnSO4和CaCl2對紅曲霉MP60-6產Monacolin K的影響，結果見圖4。

由圖4可知，MgSO4、ZnSO4在一定質量濃度范圍內對于紅曲霉MP60-6產生Monacolin K都具有一定的促進作用，其中以MgSO4的促進作用更為明顯，而CaCl2的作用則微乎其微。結果表明，MgSO4質量濃度在1 g/L時對Monacolin K的產量提高效果最顯著，MgSO4質量濃度＞1 g/L時Monacolin K的產量反而有所下降；同樣，ZnSO4質量濃度在達到2 g/L時Monacolin K的產量達到最高。因此，選擇在發酵培養基中添加1 g/L MgSO4和2 g/L ZnSO4。

2.6 添加乙酸和檸檬酸對紅曲霉產生Monacolin K的影響

大量文獻報道，在紅曲霉發酵過程中添加乙酸或檸檬酸有利于提高Monacolin K的產量[2，17-18]。在發酵開始的第3、第4天每天分兩次分別添加0.1%、0.2%和0.3%的乙酸或檸檬酸，然后比較其Monacolin K的產量，結果見圖5。

由圖5可知，添加乙酸和檸檬酸都能夠從不同程度上促進Monacolin K的產生，并且乙酸對紅曲霉MP60-6的促進作用比檸檬酸更顯著。每次添加0.1%的乙酸和0.2%的檸檬酸能夠達到提高Monacolin K的最佳效果。這種促進作用的原因可能是：乙酸和檸檬酸都是紅曲霉代謝中產生乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）的直接前體物質，而根據已知的Monacolin K的合成途徑，胞內的乙酰CoA含量是決定Monacolin K產量的關鍵因素。因此，在發酵過程的第3、第4天每天兩次添加0.1%乙酸和0.2%檸檬酸有利于胞內乙酰CoA的積累，從而提高Monacolin K的產量。

2.7 甘油補加的時機對紅曲霉產生洛伐他汀的影響

按照1.3.1所述的培養條件，在初始碳源為50 g/L的米粉培養基中，在培養的第2、5、8、10天向不同的搖瓶中補加10%的甘油，并定時取樣，檢測其Monacolin K合成的情況，結果見圖6。

由圖6可知，第8天和第10天開始補加甘油的搖瓶中紅曲霉產生Monacolin K的產量明顯高于其他搖瓶的產量，并且以第8天補加的效果最佳。同時，第2天和第5天補加甘油Monacolin K的產量比不補加甘油的對照產量還要低。這說明作為次級代謝產物的Monacolin K是在菌體生長后期開始大量積累，前期生長過快反而不利于其產生；從Monacolin K的合成曲線上看，發酵中Monacolin K的大量積累集中在第12～17天，這一階段的積累速度呈指數增長。而從補加碳源上來看，在第8天補加甘油后，到了第12天Monacolin K才開始大量積累，這說明Monacolin K的積累需要一定的“準備期”。因此，在發酵的第8天補加10%的甘油對于提高Monacolin K產量效果最佳。

3 結論

利用ARTP等離子流誘變技術對紅曲霉ZH01進行誘變處理，并建立構巢曲霉對峙培養快速篩選方法，獲得4株Monacolin K產量顯著提高的紅曲霉菌株。經遺傳穩定性實驗分析后，最終選擇MP60-6作為生產菌株，該菌Monacolin K產量較出發菌株提高了60%以上。

該文考察了紅曲霉MP60-6發酵中碳源、氮源、無機鹽以及添加乙酸、檸檬酸和甘油等對其Monacolin K產量的影響，確定甘油為最佳速效碳源；蛋白胨和NaNO3分別為最佳有機和無機氮源；MgSO4和ZnSO4有利于促進Monacolin K的產生，而CaCl2的影響不明顯；添加乙酸和檸檬酸都能提高Monacolin K產量，最佳濃度添加量分別為0.1%和0.2%；Monacolin K在發酵后期開始大量積累，在發酵的第8天補加甘油能顯著提高Monacolin K的產量。經過初步優化培養基成分及發酵條件，紅曲霉MP60-6液態發酵Monacolin K的最終產量可達到1 302 mg/L，為出發菌株ZH01產量（489.3 mg/L）的2.66倍。

[1]ENDO A.Monacolin K.A new hypocholesterolemic agent produced by a Monascusspecies[J].J Antibiot,1979,32(8):852-854.

[2]孫偉，劉愛英，梁宗琦.紅曲中莫納可林K（Monacolin K）的研究進展[J].西南農業學報，2003，16（3）：112-116.

[3]李永麗.高產Monacolin K功能紅曲的誘變篩選及應用[D].武漢：武漢工業學院碩士論文，2010.

[4]陳曄，朱華，許贛榮.紅曲霉9901液態發酵產莫納可林K的發酵條件[J].食品與發酵工業，2004，30（1）：57-61.

[5]危勤濤，張慶慶，劉輝，等.紅曲霉液態發酵產洛伐他汀條件的研究[J].安徽工程科技學院學報：自然科學版，2008，23（4）：40-43.

[6]賈波.紅曲霉深層發酵生產Monacolin K的研究[D].杭州：浙江工業大學碩士論文，2003.

[7]游玟娟，溫擁軍，李援.高產洛伐他汀紅曲霉復合誘變育種[J].食品工業科技，2014，35（22）：213-215.

[8]李滔滔.高產洛伐他汀紅曲霉菌誘變育種及其在醬油廢水中的應用[D].株洲：湖南工業大學碩士論文，2013.

[9]李盡哲，王偉，黃雅琴.超高壓對洛伐他汀生產菌株的誘變研究[J].中國釀造，2011，30（4）：58-61.

[10]鄒曉，蓋棟梁，孫嘉龍，等.紫紅曲霉的復合誘變及培養條件優化[J].貴州農業科學，2009，37（6）：78-82.

[11]宋紅平，李梅，馮琳，等.重離子束-紫外線復合誘變選育高產Lovastatin土曲霉菌株[J].食品科學，2013，34（3）：158-162.

[12]戴德慧，郭愛蓮，蔣家新.He-Ne激光對紅曲霉M9x的原生質體誘變育種[J].食品科學，2005，26（11）：75-78.

[13]成劍峰，王勇亮，何于飛，等.一株紅曲霉菌種的誘變選育及其功能性產物測定[J].中國釀造，2009，28（9）：150-155.

[14]李晶，馬貴民，馮曉明，等.紅曲霉固態發酵生產洛伐他汀工藝條件研究[J].安徽農學通報，2014（17）：29-30.

[15]魏巍.紅曲霉發酵合成洛伐他汀的研究[D].武漢：華中科技大學碩士論文，2013.

[16]王偉，黃雅琴，李盡哲.洛伐他汀菌種發酵配方的正交試驗[J].中國釀造，2012，31（3）：39-41.

[17]李亞莉，黑利生，秘鳴，等.1株紫色紅曲菌（MPT13）產洛伐他汀發酵條件的優化[J].食品工業，2013（8）：70-72.

[18]ZHANG J,WANG Y L,LU L P,et al.Enhanced production of Monacolin K by addition of precursors and surfactants in submerged fermentation ofMonascus purpureus9901[J].Biotechnol Appl Bioc,2014,61 (2):202-207.

Screening ofMonascuswith high Monacolin K yield and optimization of its liquid-state fermentation condition

CHEN Quan1,WU Yuanzheng1,HU Jindong1,WANG Yilian1,ZHAO Xiaoyan1,ZHAO Jixing2,LI Yao2,LI Jishun1*
(1.Shandong Provincial Key Laboratory for Applied Microorganism,Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014,China;2.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Huimin 251706,China)

In order to improve the production of Monacolin K byMonascus,a novel method based on the Atmospheric and Room Temperature Plasma(ARTP)was applied to screen theMonascusstrain with higher Monacolin K yield.A mutant strain MP60-6 was obtained through the screening method of plate confrontation culture ofAspergillus nidulans,and the yield of Monacolin K by MP60-6 was 60%higher than that of the initial strain. The optimal medium compositions were obtained as follows:glycerol 5%,rice powder 50 g/L,peptone 15 g/L,NaNO32 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L, ZnSO42 g/L,KH2PO41.5 g/L.And 0.1%acetate and 0.2%citrate were added at the 3thand 4thdays,10%glycerol was added at the 8thday in the liquid-state fermentation of MP60-6.After cultivation for 17 d under the optimized condition,the Monacolin K yield was 1 302 mg/L,which was 2.66 times of the original strain.

Monacolin K;Monascus;mutation;liquid-state fermentation

Q939.9

A

0254-5071（2015）06-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.010

2015-05-04

山東省科學院青年基金項目資助（2013QN018）；山東省自主創新專項項目（2013CXC20605）

陳泉（1981-），男，助理研究員，博士，研究方向為微生物代謝。

*通訊作者：李紀順（1971-），男，高級工程師，本科，研究方向為應用微生物。