紅曲霉菌體殘渣酶解條件優化研究

周紅姿，李紀順，劉 新，吳遠征，趙吉興，李 耀

（1.山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南250014；2.山東省科學院生物所，山東濟南250014；3.山東中惠生物科技股份有限公司，山東濱州251707)

紅曲霉菌體殘渣酶解條件優化研究

周紅姿1，李紀順1*，劉 新2，吳遠征1，趙吉興3，李 耀3

（1.山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南250014；2.山東省科學院生物所，山東濟南250014；3.山東中惠生物科技股份有限公司，山東濱州251707)

為提高紅曲霉菌（Monascus purpureus）體殘渣的利用率，采用機械破壁和酶解結合方法釋放胞內蛋白。細胞破碎液經纖維素酶與復合酶聯合處理，通過正交試驗確定最佳的水解條件為紅曲霉菌體殘渣質量濃度60 g/L、酸性纖維素酶用量1.0%、復合酶用量0.5%、水解時間36 h。在此條件下，紅曲霉菌體殘渣的失重率達到27.86%，總糖含量達到7.38 g/L，小肽含量達到83.95 mg/g，游離氨基酸含量達到22.31 mg/g。

紅曲霉菌；纖維素酶；復合酶；總糖；小肽；游離氨基酸

紅曲以秈米為原料，采用現代生物工程技術分離出優質的紅曲霉菌（Monascus purpureus）經液體深層發酵精制而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。采用紅曲霉制備紅曲的歷史悠久，在發酵培養過程中能產生大量紅曲色素[1-3]，此外還能產生多種次級代謝產物，如莫納可林K、洛伐他汀、幾丁質酶、輔酶Q10等，因此紅曲具有降膽固醇、降血壓、降血糖以及預防冠心病和治療骨質疏松疾病等功能[4-7]。我國很多企業利用紅曲霉進行工業化生產紅曲色素，浸提色素后，形成大量紅曲霉菌體殘渣（以下簡稱菌渣），富含蛋白質和活性物質，現主要應用于生產蛋白飼料，但其中很多大分子活性物質不利于人畜吸收，目前對菌渣酶解前后營養成分的變化規律研究很少，本試驗在前人研究基礎上[8-10]，研究其酶解前后營養成分變化規律，采用機械破碎和纖維素酶結合方法釋放出多糖及菌體內蛋白，通過酶解將這些大分子物質降解成小分子，提升菌渣的營養品質，提高其利用率，為使菌渣得到高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌渣：山東中惠生物科技股份有限公司；酸性纖維素酶（100 000 U/g）：山東隆大生物工程有限公司；諾維信纖維素酶（100 U/g）：諾維信中國投資有限公司；和氏璧纖維素酶（100 000 U/g）、復合酶（中性蛋白酶60 000 U/g、β-葡聚糖酶2 000 U/g、纖維素酶30 000 U/g）：和氏璧生物技術有限公司；D-葡萄糖標準品（純度≥98%）：大連美侖生物技術有限公司；苯酚（分析純）、三氯乙酸、三氟乙酸（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：萊陽市鐵塔化工制品廠；甲醇（色譜純）：美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-60SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZQ-Q全溫振蕩器：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；Agilent 1260 Infinity液相色譜儀：美國Agilent公司；KQ-400KDE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；細胞型1820D Molecular超純水儀：重慶摩爾水處理設備有限公司；TU-1810紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FA1004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；HITACHI CR22GⅢ型離心機、L-8900氨基酸分析儀：日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌渣破碎前處理

菌渣粉碎后，過100目篩，獲得菌渣粉備用。

1.3.2 菌渣粉中粗蛋白及氨基酸含量的測定

凱氏定氮法[11]檢測菌渣粉的粗蛋白含量；氨基酸測定儀檢測菌渣粉中氨基酸含量。

1.3.3 菌體細胞破碎與酶解水解菌渣蛋白

稱量適量菌渣粉，加入蒸餾水在低溫條件下溶脹16 h，膠體磨研磨80 min，并在121℃滅菌30 min，待其涼后按照產品推薦量分別加入1%酸性纖維素酶、1%和氏璧纖維素酶、3%諾維信纖維素酶，混勻，置于37℃、160 r/min條件下酶解24 h，再分別在無菌條件下加入0.5%復合酶，37℃、160 r/min條件下繼續酶解24 h后，將水解液6 000×g離心10 min，收集菌渣，烘干至質量恒定后測定菌渣失重率，以失重率反映菌渣蛋白水解程度，其計算公式：

1.3.4 正交試驗設計

根據前期預試驗，采用L9（34）正交試驗，選取菌渣質量濃度（A）、酸性纖維素酶添加量（B）、復合酶添加量（C）和水解時間（D）這四個因素作為考察因素，以菌渣失重率為評價指標，考察酶解條件對菌渣失重率的影響。每個因素取3個水平。每個處理設3個重復。正交試驗因素與水平見表1。

1.3.5 菌渣水解液總糖檢測

葡萄糖標準曲線的制作：精密稱取105℃干燥至恒質量的D-葡萄糖標準品200.000 mg，加適量水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配成質量濃度為2.00 mg/mL的葡萄糖標準液。分別吸取葡萄糖標準溶液0.1 mL、0.2 mL、 0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至15 mL具塞試管中，加蒸餾水補足至1 mL，加入5%苯酚溶液0.6 mL，搖勻，再迅速加入3 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴中加熱顯色反應15 min，迅速冷卻至室溫。另以蒸餾水1 mL同上操作加苯酚和硫酸進行顯色反應，作為空白對照。在最大吸收波長489 nm處測定吸光度值，以質量濃度為橫坐標（x），以吸光度值為縱坐標（y），進行線性回歸。

苯酚-硫酸比色法測定菌渣水解液中總糖含量[12]：精密量取菌渣水解液0.2mL，取蒸餾水稀釋并定容至50 mL容量瓶中，精確量取供試液1 mL于具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.6mL，搖勻，再迅速加入3mL濃硫酸，搖勻，沸水浴中加熱顯色反應15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白對照，于波長489 nm處測定吸光度值。根據回歸方程，計算得到葡萄糖含量，以葡萄糖計水解液中總糖含量。

1.3.6 菌渣水解液高效液相色譜檢測小分子化合物

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀檢測小分子化合物。色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm× 5 μm），流動相A為體積分數為1%三氟乙酸水溶液，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%～100%B；45～55 min，100%B；55～56 min，100%～5%B。檢測器是二極管陣列（diodearraydetector，DAD）檢測器，檢測波長270 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，分析時間58 min；系統平衡色譜柱時間為15 min。

1.3.7 菌渣及菌渣水解液中小肽含量和總游離氨基酸含量檢測

總游離氨基酸含量測定[13]：取5mL樣品上清液于10mL試管中，準確加入5 mL 5%三氟乙酸溶液，混勻，于4℃7 000×g離心20 min，用0.45 μm的無機濾膜過濾。吸取濾液20 μL待測液注入L-8900全自動氨基酸分析儀，采用外標法定量測定。

取適量菌渣水溶液及水解液，等體積加入10%三氯乙酸，在160 r/min搖床上振蕩30 min，4 000×g離心10 min，各取上清液10 mL于消化管中，按測定粗蛋白質方法消化、定容至100 mL。移取10 mL消化液蒸餾，測定菌渣水溶液及水解液中粗蛋白質含量。同時以蒸餾水作為空白。

氨基酸態氮含量[14]：依據GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中的甲醛值法進行測定。

小肽含量=粗蛋白含量－氨基酸態氮含量

2 結果與分析

2.1 菌渣粉中氨基酸含量和蛋白測定

凱氏定氮法檢測菌渣粉的蛋白含量為38.41%。菌渣粉中氨基酸含量檢測結果見表2。

由表2可知，菌渣粉中的蛋白質含有17種氨基酸，氨基酸總含量占菌渣的21.90%，其中必需氨基酸占氨基酸總含量的37.20%，說明菌渣粉有較好的營養價值。

2.2 不同纖維素酶水解菌渣蛋白

菌渣溶液滅菌后，分別加入1%酸性纖維素酶、1%和氏璧纖維素酶及3%諾維信纖維素酶，混勻，置于37℃、160r/min條件下酶解24 h，再分別在無菌條件下加入0.5%復合酶，37℃、160 r/min條件下繼續酶解24 h后，將水解液6 000×g離心10 min，收集菌渣，烘干至質量恒定后測定菌渣失重率，結果見圖1。

由圖1可以看出，經纖維素酶、復合酶處理的樣品，菌渣失重率差異明顯，其中酸性纖維素酶的處理失重率最高，達16.72%，諾維信纖維素酶處理其次，為15.58%，和氏璧纖維素酶處理最低，為14.42%，因此后續試驗均采用酸性纖維素酶聯合復合酶共同水解菌渣。

2.3 酶解條件優化正交試驗

本試驗選取菌渣質量濃度（A）、酸性纖維素酶添加量（B）、復合酶添加量（C）和水解時間（D）為考察因素，以菌渣失重率作為試驗考察指標，正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，4因素對菌渣失重率的影響作用大小依次為C＞A＞D＞B，即復合酶添加量＞菌渣質量濃度＞水解時間＞酸性纖維素酶添加量。最佳水平組合為A2B3C2D2，即最佳優化組合為菌渣質量濃度60 g/L、酸性纖維素酶添加量1.0%、復合酶添加量0.5%、水解時間36 h。在此最佳條件下進行驗證試驗，重復3次，平均失重率27.86%。

由表4可知，A、C、D因素對結果影響差異顯著（P＜0.05），B因素對結果影響差異不顯著（P＜0.05）。

2.4 菌渣水解液總糖檢測

2.4.1 葡萄糖標準曲線的建立

在最大吸收波長489 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質量濃度為橫坐標（x），以吸光度值為縱坐標（y），繪制葡萄糖標準曲線見圖2。標準曲線線性回歸方程：y=1.607 5x，相關系數R2=0.991 8。結果表明，葡萄糖在0～2 mg/mL與吸光度值之間呈良好的線性關系。

2.4.2 菌渣水解液總糖測定

按照苯酚-硫酸比色法檢測菌渣粗粉碎60 g/L水溶液中總糖（以葡萄糖計）含量為0.73 g/L，在最佳條件下60 g/L菌渣水解液中的總糖（以葡萄糖計）含量為7.38 g/L，酶解后總糖含量提高了10倍。

2.5 液相色譜檢測菌渣水解液小分子化合物組分

取菌渣溶液（作為對照）和最佳條件下水解液的上清液進行高效液相色譜檢測，結果見圖3。

由圖3可知，最佳條件下菌渣水解液中的小分子化合物組分比對照中的發生了明顯變化，在保留時間較小的時間范圍內，小分子化合物組分種類明顯增多，而在保留時間較大的時間范圍里的種類有所減少，總體上，最佳條件下菌渣水解液中的小分子化合物組分種類明顯增多，說明經過水解后菌渣中的組分發生了明顯變化，其中很多大分子物質被降解成更易于吸收的小分子化合物。

2.6 最佳條件下菌渣水解液中小肽含量和總游離氨基酸檢測

在此最佳優化組合下進行試驗，取水解液進行小肽含量檢測，發現小肽含量達最大值83.95mg/g干料，而水解前菌渣粉中小肽含量為0.72 mg/g干料，說明菌渣經過酶解后，蛋白被降解成小肽，更有益于人畜吸收，提升了菌渣的營養品質。

氨基酸本身呈現出酸、甜、苦、鮮等各種味道，甜味類氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸，鮮味類氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸，呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸[15]。由表5可知，從水解液中共檢出16種游離氨基酸，總游離氨基酸含量最高達到22.31 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸組成的10.19%，其中必需氨基酸量達到13.28 mg/g干料，占菌渣水解液氨基酸組成6.06%。呈鮮味的天門冬氨酸占總游離氨基酸量的0.67%，呈甜味的氨基酸（絲氨酸、脯氨酸）占總游離氨基酸含量的1.43%，使水解液散發出香甜味，有助于提高人的食欲。

3 結論

紅曲菌體殘渣是生產紅曲色素形成的下腳料，其中含有大量的纖維素等大分子化合物，蛋白含量高達38.41%，目前主要用于生產動物的蛋白飼料，但其中蛋白質分子較大，大部分為胞內蛋白，殘渣中游離氨基酸的含量極低，不易于被人畜充分吸收。通過細胞破碎結合纖維素酶水解，可將殘渣中的纖維素等大分子化合物降解為人畜易消化利用的養分，同時釋放胞內蛋白，并在復合酶作用下，菌渣的大分子蛋白被降解為小分子蛋白、小肽及游離氨基酸。結果表明，菌渣質量濃度、復合酶添加量、反應時間均對蛋白水解有顯著影響，最佳酶解條件為菌渣質量濃度為60g/L、酸性纖維素酶添加量為1.0%、復合酶添加量為0.5%、水解時間為36h。在此最佳條件下，菌渣蛋白的失重率可達27.86%，總糖含量達到7.38 g/L，通過高效液相色譜檢測，發現水解液中的小分子化合物組成明顯增多，水解液小肽含量達到83.95 mg/g，游離氨基酸含量達到22.31 mg/g。

菌渣經過處理后，大分子物質含量降低，可溶性蛋白、小肽、游離氨基酸及可溶性總糖含量大大提高，有利于人畜的吸收，提高消化吸收率，改善適口性，使其品質得到一定程度的提升，提高了菌渣的綜合利用率，為將其開發成高營養價值的保健產品提供了理論參考。

[1]全桂靜，曹金麗.液態發酵產紅曲色素穩定性的研究[J].中國食品添加劑，2014，128（7）：113-115.

[2]譚海剛，李靜.產紅曲色素菌株的篩選及發酵培養基優化[J].中國調味品，2013，38（7）：50-53.

[3]梁彬霞，白衛東，楊曉暾，等.紅曲色素的功能特性研究進展[J].中國釀造，2012，31（3）：21-24.

[4]ENDO A.Monacolin K.A new hypocholiestrolemic agent produced by a Monascusspecies[J].J Antibiot,1979,32(8):852-854.

[5]陳平，羅金亮，周禮紅.紅曲代謝產物研究的現狀和前景[J].江蘇調味副食品，2009，26（4）：26-29.

[6]危勤濤，張慶慶，劉輝，等.紅曲霉液態發酵產洛伐他汀條件的研究[J].安徽工程科技學院學報：自然科學版，2008，23（4）：23-29.

[7]WANG S L,HSIAO W J,CHANG W T.Purification and characterization of antimicrobial chitinase extracellularly produced byMonascus purpureusCCRC31499 in a shrimp and crab shell powder medium[J].J Agr Food Chem,2002,50(8):2249-2255.

[8]鄧毛程，李靜，顧宗珠，等.紅曲霉菌體蛋白復合酶解的研究[J].中國釀造，2011，30（12）：148-151.

[9]顧宗珠，李靜，王瑤，等.堿性蛋白酶水解紅曲霉菌體的研究[J].食品與機械，2012，28（3）：223-225.

[10]魏金濤，趙娜，李紹章，等.復合酶酶解豆粕營養成分變化規律研究[J].中國糧油學報，2014，29（1）：17-20，25.

[11]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術[M].北京：高等教育出版社，1997.

[12]王瑞海，柏冬，劉麗梅.比色法測定大蒜多糖提取物中總多糖含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（10）：158-161.

[13]劉東娜，鄭曉娟，卿鈺，等.蒙頂山名茶游離氨基酸總量及組分的測定分析[J].四川農業大學學報，2012，30（2）：190-194，209.

[14]GB/T 5009.1—2003食品衛生檢驗方法理化部分（一）[S].北京：中國標準出版社，2004.

[15]LAURA P N,GILLES DE R L,ALAIN B,et al.Formation of flavor components by the reaction of amino acids and carbonyl compounds in mild conditions[J].J Agr Food Chem,2000,48(9):3761-3766.

Optimization of enzymatic hydrolysis of the residue fromMonascus purpureus

ZHOU Hongzi1,LI Jishun1*,LIU Xin2,WU Yuanzheng1,ZHAO Jixing3,LI Yao3
(1.Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences,Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014,China;2.Biology Institute of Shandong Academy of Sciences,Jinan 250014,China; 3.Shandong Zhonghui Biotechnology Co.,Ltd.,Binzhou 251707,China)

In order to improve the utilization rate of the residue fromMonascus purpureus,mechanical wall-breaking method combined with cellulase was used to release the intracellular protein.The wall-breaking liquid was treated by acid cellulase and compound enzymes.Through orthogonal test, the optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows:M.purpureusresidue concentration 60 g/L,acid cellulase 1.0%,compound enzyme 0.5%,and reaction time 36 h.Under these conditions,the weight-loss rate of the residue was 27.86%,the total sugar content was up to 7.38 g/L,the peptide content was up to 83.95 mg/g,and the free amino acid content was up to 22.31 mg/g.

Monascus purpureus;cellulase;compound enzyme;total sugar;peptide;free amino acid

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.011

2015-05-04

山東省科技發展計劃（2014GSF121035）

周紅姿（1976-），女，副研究員，碩士，研究方向為應用微生物。

*通訊作者：李紀順（1971-），男，高級工程師，本科，研究方向為應用微生物。