微波和高溫滅菌對神仙豆活性成分及其抗氧化性的影響

劉 瑋，葉 川，林 琳，姜紹通，陸劍鋒

（合肥工業大學生物與食品工程學院，合肥230009）

微波和高溫滅菌對神仙豆活性成分及其抗氧化性的影響

劉 瑋，葉 川，林 琳，姜紹通，陸劍鋒*

（合肥工業大學生物與食品工程學院，合肥230009）

為研究微波和高溫滅菌對神仙豆品質的潛在影響，分析了處理前后神仙豆主要活性成分和抗氧化性的變化。結果表明，除總糖和粗纖維含量變化均不顯著外(P＞0.05)，兩種滅菌方式均導致神仙豆活性成分含量的不同程度降低；高溫滅菌后，神仙豆氨基酸態氮降低9.52%(P＜0.05)，蛋白質降低14.96%(P＜0.05)，還原糖降低33.75%(P＜0.05)，類黑精降低61.29%(P＜0.05)，異黃酮降低5.00% (P＞0.05)；微波滅菌后，神仙豆氨基酸態氮降低19.05%(P＜0.05)，蛋白質降低1.11%(P＞0.05)，還原糖降低28.75%(P＜0.05)，類黑精降低70.97%(P＜0.05)，異黃酮降低20.00%(P＜0.05)；在抗氧化性方面，除對·OH的清除活性外，微波滅菌處理的神仙豆抗氧化性均相對高于高溫滅菌組。綜合來說，微波滅菌處理的神仙豆抗氧化性相對較高。

神仙豆；活性成分；高溫；微波；抗氧化

豆豉是一種傳統調味副食品，在我國有著悠久的歷史，其豉香誘人、營養豐富、風味獨特，深受消費者歡迎[1]。豆豉不僅營養豐富，而且含有許多具有生理功能的活性物質，具有預防糖尿病、抗氧化、降血壓、溶血栓等作用[2]。豆豉的抗氧化成分按其來源大致分為兩類：一類是大豆中本身具有的天然抗氧化成分（如酚酸類、維生素C、類黑精、異黃酮等化合物）；另一類是加工過程中利用微生物及其酶的綜合作用所形成的抗氧化物質[3]。神仙豆是淮南地區民間的一種特色自然發酵豆制品，經精選、浸泡、蒸煮、發酵、成熟、炒制等傳統工藝制備得到[4]。與納豆（Natto）相似，神仙豆屬于細菌型豆豉制品[6]，主要利用枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）繁殖于蒸熟的大豆上，借助其蛋白酶產出獨特的風味[5]。

已有的研究表明，在大豆發酵過程中，大分子有機物在微生物及酶的作用下進行分解和重組，同時經過復雜的生化作用形成代謝產物和變性物質（如蛋白質分解為多肽和氨基酸、異黃酮糖苷轉化為生理活性較高的苷元，以及美拉德反應生成類黑精等），這些成分均有助于增強豆豉的抗氧化性[7-8]。但在食品加工后期，采用不同的滅菌處理方式可能會直接影響或改變食品的物理和化學性質（如蛋白質、維生素、芳香物質等熱敏性營養素的降解及損失）[9]。與新鮮樣品相比，經微波加熱后的食品，其酚酸類和黃酮類物質的含量可能出現下降，如ZHANG M等[10]將韃靼蕎麥提取物置于700W功率的微波爐中加熱10min，其類黃酮多酚物質顯著減少。同時，微波可能會影響食品的抗氧化活性，如CHUAH A M等[11]將青椒、紅辣椒、青椒粉、紅椒粉等置于500 W功率微波爐中加熱5 min，發現樣品清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力降低；ZHANG D等[12]將花椰菜的花及莖于600 W微波中分別加熱30 s、60 s、90 s、120 s、300 s，發現樣品總抗氧化活性和酚類物質的抗氧化活性均逐漸減小。此外，高溫滅菌對豆類食品的活性物質和抗氧化性也有不同程度的影響。如XU B等[13]研究了高溫處理對黃豆和黑豆總酚、酚酸、異黃酮、花青素及其抗氧化性的影響，發現水煮和蒸煮均導致兩種豆子活性成分和抗氧化性不同程度降低；ARCAN I等[14]研究了不同熱處理條件對鷹嘴豆和白豆蛋白水提物抗氧化性的影響，發現經121℃、20 min滅菌后，鷹嘴豆的Fe2+螯合能力提升了1.8倍，而白豆的Fe2+螯合能力卻降低了2.3倍。

豆豉的活性成分包括氨基酸態氮、蛋白質、還原糖、類黑精、異黃酮等多項指標。為研究不同滅菌處理對神仙豆品質的潛在影響，采用微波和高溫兩種方式，分析了處理前后神仙豆活性成分的變化。并以維生素C為陽性對照，選取羥自由基（·OH）清除活性、DPPH自由基清除活性、Fe3+還原能力和亞油酸自氧化抑制能力等指標測定滅菌前后的神仙豆抗氧化性。本研究可為神仙豆選擇合理的殺菌方式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

神仙豆制品：安徽淮南市焦崗湖忠輝食品有限公司，滅菌處理后的樣品在4℃保藏直至使用。

主要試劑：抗壞血酸（VC），水楊酸、乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、DPPH、鐵氰化鉀、三氟乙酸、硫酸亞鐵、亞油酸、硫氰酸銨等均為分析純：合肥美豐化工儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

Hanon K9840自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海大普儀器有限公司；HH-2數顯水浴鍋：江蘇金壇市環宇科學儀器廠；DT5-4低速離心機：北京時代北利離心機有限公司；SA8自動旋渦振蕩混合器：英國STUART公司；722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；90-3定時恒溫磁力攪拌器：上海滬西分析儀器有限公司；FD-1B-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

豆豉原料采用傳統工藝發酵制備，發酵成熟后進行加料炒制，最后真空包裝，并進行滅菌處理（高溫滅菌：壓力0.10～0.15 MPa，溫度100℃，時間10 min；微波滅菌：功率1 300 W，時間90 s[15]）。采用未滅菌的作對照，用研缽研磨成粉末后進行真空冷凍干燥，并粉碎過60目篩，最后放入4℃冰箱備用。

1.3.2 類黑精含量的測定[16]

取5 g樣品，用體積分數10%的乙醇定容至200 mL，充分振蕩，室溫靜置24 h，濾紙過濾，4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液用可見光分光光度計在波長470 nm處比色。類黑精含量按如下公式計算：

式中：C為類黑精含量，%；As為樣液吸光度值；V為定容體積，mL；M為樣品質量，g；0.269為1 mL水溶液含0.1 mg醬油類黑精的吸光度值。

1.3.3 異黃酮含量的測定[17]

取0.1 g樣品，加入體積分數80%的乙醇，液料比為20∶1（mL∶g），在50℃提取1 h后離心，倒出浸提液，再用相同體積的溶劑浸提濾餅，合并兩次浸提液，用紫外分光光度計在波長260 nm處測定吸光度值。

繪制標準曲線：稱取金雀異黃素標準品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，以80%乙醇溶解并定容，搖勻。精確吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL金雀異黃素標準品溶液于10mL容量瓶中，用體積分數80%的乙醇定容至刻度，搖勻。以體積分數80%的乙醇作為空白對照，在波長260 nm處用紫外分光光度計測吸光度值，以測得的吸光度值（Y）與金雀異黃素標準品量（x）得出線性回歸方程：Y=0.1217x+0.008 8，R2=0.998 9，由此計算異黃酮含量。金雀異黃素標準曲線見圖1。

1.3.4 其他理化成分的測定

蛋白質含量的測定采用國標GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；氨基酸態氮含量的測定采用國標GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中甲醛值法；還原糖含量的測定采用國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》的直接滴定法；總糖含量的測定采用國標GB/T15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》中的苯酚比色法；粗纖維含量的測定采用國標GB5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》中的重量法。

1.3.5羥自由基清除活性的測定

參考王艷梅等[18]的方法并作修改。采用Fenton反應，利用H2O2與Fe2+混合產生羥基自由基，加入水楊酸到該體系中捕捉羥基自由基并產生有色物質，該物質在波長510 nm處有最大吸收峰。將樣品中加入無菌蒸餾水配制成一定的質量濃度，加入一定質量濃度樣品4 mL，9 mmol/LFeSO40.5 mL，9 mmol/L水楊酸0.5 mL，8.8 mmol/L H2O20.5 mL，混勻，37℃水浴中加熱30 min，于波長510 nm處用可見光分光光度計測定樣品吸光度值，將體系中的樣品改為加入4 mL蒸餾水，測定得空白對照吸光度值，向體系中加入0.5 mL蒸餾水代替8.8mmol/LH2O2時，測定得樣品本底吸光度值，以維生素C作陽性對照，用以下公式計算清除率：

式中：A1表示樣品本底吸光度值；A2表示空白對照吸光度值；A0表示樣品吸光度值。

1.3.6 DPPH自由基清除活性的測定

參考高義霞等[19]的方法并作修改。將樣品加入無菌蒸餾水配制成一定的質量濃度，取2mL樣品液和2mL1×10-4mol/L DPPH溶液（用體積分數95%的乙醇配制）加入同一具加塞試管中搖勻，室溫條件下密閉放置30 min，在波長517 nm處測定吸光度值，以2 mL體積分數95%的乙醇加入2 mL蒸餾水混勻的溶液為參比。DPPH自由基清除率的計算公式：

式中：A1表示樣品液＋DPPH溶液的吸光度值；A2表示樣品液＋體積分數95%乙醇溶液的吸光度值；A0表示DPPH溶液＋蒸餾水的吸光度值。

1.3.7 還原能力的測定

參考榮建華等[20]的方法并作修改。將樣品粉末加入無菌蒸餾水配制成一定的質量濃度，取2mL樣品液加入2.5mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，在50℃保溫20 min后加入2.5 mL10%的三氟乙酸，混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，測定其在波長700 nm處的吸光度值。吸光度值越大，則還原能力越強。

1.3.8 亞油酸自氧化抑制能力的測定

參考WU H C等[21]的方法并作修改。將0.5 mL不同質量濃度的樣品溶液、4.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液和2.0 mL亞油酸乳化液（2.5 mL亞油酸加入100 mL體積分數95%乙醇中）加入試管中加塞搖勻，于60℃避光反應24h。取50 μL反應液，依次分別加入4.0 mL體積分數75%的乙醇，50μL30%的硫氰酸銨溶液及50μL20mmol/LFeCl2溶液（以3.5%HCl配成），振蕩混勻，3 min后在波長500 nm處測定吸光度值。吸光度值越小，則樣品抑制亞油酸自氧化能力越強。

1.4 數據處理與分析

所有數據結果均為3次重復試驗平均值，以平均值±標準差表示，并用Excel進行數據分析和作圖，用SPSS 19對活性成分的變化進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 滅菌處理后神仙豆主要活性成分的變化

神仙豆的主要活性成分及含量見表1。由表1可知，神仙豆經微波和高溫滅菌處理后，除總糖和粗纖維含量變化不顯著外（P＞0.05），其主要活性成分含量均呈現不同程度的下降。但相比之下，高溫滅菌對神仙豆氨基酸態氮、類黑精和異黃酮等指標的下降幅度影響較小，而微波滅菌對神仙豆蛋白質和還原糖的下降幅度影響較小。高溫滅菌后，神仙豆異黃酮減少5.00%（P＞0.05），類黑精降低61.29%（P＜0.05），還原糖降低33.75%（P＜0.05），氨基酸態氮降低9.52%（P＜0.05），蛋白質降低14.96%（P＜0.05）；微波滅菌后，神仙豆異黃酮降低20.00%（P＜0.05），類黑精降低70.97%（P＜0.05），還原糖降低28.75%（P＜0.05），氨基酸態氮降低19.05%（P＜0.05），蛋白質降低1.11%（P＞0.05）。由此可見，采用兩種滅菌處理均將導致神仙豆的活性成分含量降低，但大豆異黃酮受高溫滅菌的破壞程度低于微波滅菌，這可能是由于大豆異黃酮的熱穩定性相對較高的緣故[22]。然而，雖然高溫滅菌對異黃酮的破壞程度低，但高溫處理會促使蛋白質或多肽形成二硫鍵，加劇蛋白質或多肽的凝集和沉淀[23]，而且也會直接導致蛋白質或多肽顯著降解（P＜0.05），最終造成神仙豆總蛋白或多肽活性顯著降低。

2.2 滅菌處理后神仙豆的抗氧化性變化

2.2.1 對羥自由基的清除活性的影響

羥自由基（·OH）是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，·OH也是已知的最強的一種氧化劑，幾乎可以和所有的生物大分子發生不同類型的反應，氧化效率高，反應速度快，能夠引起膜脂、蛋白質和核酸的氧化損傷，導致細胞衰老、死亡和機體病變[24]。各種處理條件下的神仙豆和VC對羥自由基的清除活性見圖2。由圖2可知，當樣品質量濃度＞1.0 mg/mL時，對·OH的清除效果為VC組＞未滅菌組＞高溫滅菌組＞微波滅菌組，且樣品對·OH的清除能力與質量濃度均呈現出明顯的量效關系，但顯著性分析的結果表明，未滅菌、高溫滅菌和微波滅菌組之間對·OH的清除效果均無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.2 對DPPH自由基的清除活性的影響

DPPH自由基是一種很穩定的自由基，DPPH-乙醇溶液呈深紫色，在波長517nm處有最大吸收峰[18]。抗氧化劑存在時與DPPH的孤對電子進行配對，溶液的紫色減弱，吸光度值也隨之減小，且吸光度值減小的程度與配對電子數呈劑量關系，可借此來評價物質的抗氧化活性[25]。各種處理條件下的神仙豆和VC對DPPH自由基的清除活性見圖3。由圖3可知，對DPPH呈現的清除活性為VC＞微波滅菌組＞高溫滅菌組＞未滅菌組。顯著性分析的結果表明，微波滅菌組對DPPH的清除活性顯著高于高溫滅菌組和未滅菌組（P＜0.05），但高溫滅菌組和未滅菌組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 對Fe3+還原力的影響

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原能力呈正相關關系，還原能力越強，相應的抗氧化能力也越強。抗氧化劑能夠在一定的條件下將Fe3+還原為Fe2+，可以根據Fe3+還原為Fe2+的多少來間接評價各種提取物的抗氧化能力[26]。本實驗中，還原能力大小通過波長700nm處吸光度值的大小表示。各種處理條件下的神仙豆和VC對Fe3+還原能力的影響見圖4。由圖4可知，樣品的還原能力與其質量濃度呈一定的量效關系，隨著樣品質量濃度的增加，吸光度值呈上升趨勢，樣品的吸光度值越大，表明還原能力愈強，抗氧化效果愈佳。因此，對Fe3+還原力為VC＞未滅菌組＞微波滅菌＞高溫滅菌。顯著性分析的結果表明，未滅菌組對Fe3+還原力顯著高于微波滅菌組和高溫滅菌組（P＜0.05）。

2.2.4 對亞油酸自氧化的抑制能力的影響

由于亞油酸分子中含有2個雙鍵，極易被氧化產生一系列的過氧化脂質，亞油酸體系的自氧化反應常被用來測定樣品的抗氧化活性[18]。各種處理條件下的神仙豆和VC對亞油酸自氧化反應的影響見圖5，吸光度值越小，則樣品抑制亞油酸自氧化能力越強。由圖5可知，隨著樣品質量濃度的增大，VC和神仙豆的吸光度值均呈下降趨勢，表明VC和神仙豆對亞油酸自氧化的抑制作用與質量濃度呈現出明顯的量效關系。在樣品質量濃度為0.25～2 mg/mL時，樣品吸光度值下降趨勢均顯著；而質量濃度為2～10mg/mL時，吸光度值下降平緩，其中高溫滅菌組2 mg/mL以后吸光度值基本不變。在高質量濃度區間（5～10 mg/mL），對亞油酸自氧化的抑制能力為VC＞未滅菌組＞微波滅菌組＞高溫滅菌組。但顯著性分析的結果表明，未滅菌、高溫滅菌和微波滅菌組之間對亞油酸自氧化的抑制能力均無顯著性的差異（P＞0.05）。

2.2.5 對抗氧化性變化的總體分析

除對DPPH自由基的清除活性外，相比于高溫和微波滅菌處理，未滅菌組神仙豆的抗氧化性相對較高；此外，除對·OH的清除活性外，微波滅菌處理的神仙豆抗氧化性均高于高溫滅菌組。已有的研究表明，某些食品加工過程（包括工業加工和家庭烹飪）可能會導致其抗氧化性的嚴重損失，導致這種現象的原因之一可能是許多活性物質具有相對不穩定性[27]。而豆豉在熱處理過程中將發生美拉德反應，消耗部分抗壞血酸和多酚類物質，同樣也會造成抗氧化性的降低[28]。大豆蛋白肽通常具有較高的抗氧化性，推測這可能是本試驗中高溫滅菌處理對神仙豆抗氧化性降低的影響明顯高于微波滅菌處理的主要原因。而這一推測結論也與高溫滅菌處理后神仙豆主要活性成分的變化基本一致（如蛋白顯著下降）。

3 結論

神仙豆經高溫和微波兩種滅菌方式處理后，除總糖和粗纖維含量變化不顯著外（P＞0.05），其主要活性成分均呈現不同程度的下降。

對抗氧化性的測定結果表明，對照組VC的抗氧化性最高，滅菌處理方式不同對神仙豆的抗氧化性影響較大。微波滅菌處理組在DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力方面顯著高于高溫滅菌處理組（P＜0.05），但對亞油酸自氧化抑制能力的差異不顯著（P＞0.05）；高溫滅菌處理組僅在羥自由基清除活性上高于微波滅菌處理組，但差異不顯著（P＞0.05）。因此，微波滅菌處理的神仙豆抗氧化性總體優于高溫滅菌處理組。

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Effect of high temperature and microwave sterilization on the bioactive components and antioxidant activities ofShenxianbeans

LIU Wei,YE Chuan,LIN Lin,JIANG Shaotong,LU Jianfeng*
(College of Biotechnology＆Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

In order to investigate the potential effect of high temperature and microwave treatment on the quality ofShenxianbeans,the changes of main bioactive compounds and antioxidant indexes were analyzed.The results showed that,two sterilizing methods both led to the decrease of bioactive compounds contents in different extent,aside from total sugar and crude fiber which showed no significant differences(P＞0.05).After high temperature sterilization,the contents of amino nitrogen,protein,reducing sugar,melanoidins,and isoflavone were decreased by 9.52%(P＜0.05), 14.96%(P＜0.05),33.75%(P＜0.05),61.29%(P＜0.05),and 5.00%(P＞0.05),respectively.While those treated by microwave were decreased by 19.05%(P＜0.05),1.11%(P＞0.05),28.75%(P＜0.05),70.97%(P＜0.05),and 20.00%(P＜0.05),respectively.Compared to those treated by high temperature,the antioxidant activities ofShenxianbeans treated by microwave were relatively better except for scavenging abilities on hydroxyl radical.To sum up,Shenxianbeans sterilized by microwave showed a relatively higher antioxidant effect.

Shengxianbeans;bioactive components;high temperature;microwave;antioxidant

TS214.2

A

0254-5071（2015）06-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.012

2015-05-09

國家星火計劃項目（2012GA710082）；淮南市科技計劃項目（2010A0100304）

劉瑋（1989-），男，碩士研究生，研究方向為農（水）產品加工及貯藏。

*通訊作者：陸劍鋒（1976-），男，教授，博士，研究方向為農（水）產品加工及貯藏。