不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素產量的影響

胡久平，趙 輝，周禮紅，劉 敏，陳發(fā)貴，戚珊珊，熊 燕

（1.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發(fā)酵工程研究技術中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素產量的影響

胡久平1，2，3，趙 輝1，2，3*，周禮紅2，4，劉 敏1，2，3，陳發(fā)貴1，2，3，戚珊珊1，2，3，熊 燕1，2，3

（1.西藏月王生物技術有限公司，西藏拉薩850000；2.青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心，西藏拉薩850000；3.拉薩市青稞發(fā)酵工程研究技術中心；西藏拉薩850000；4.貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽550025）

研究不同物質及添加量對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的影響，并對影響蟲草菌素產量的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。結果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素分別作為碳源、氮源、無機鹽和生長因子有利于青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素的合成、累積，且作用顯著。通過正交試驗確定不同物質對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響的主次因素為蔗糖＞蠶蛹粉＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞硫酸鎂＞酵母膏，各物質最佳添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，鏈霉素2.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在優(yōu)化配方條件下，青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量可達8 215 mg/kg。

青稞蛹蟲草；子實體；蟲草菌素；正交試驗

蟲草素（cordycepin）即3'-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine），又稱蟲草菌素是由蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]的培養(yǎng)濾液中分離得到的，蟲草菌素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素[1-2]。蟲草菌素具有多種生物活性，研究表明，蟲草菌素能特異抑制人宮頸癌細胞（Hela）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）轉錄[3]，影響Hela細胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1mRNA的表達，國產蟲草菌素可以劑量依賴方式抑制腫瘤細胞的生長，通過上調TIMP-1mRNA及蛋白的表達發(fā)揮潛在的抗腫瘤細胞侵潤轉移的作用[4]。蟲草菌素有降血糖和降血脂的作用，這為糖尿病和高脂血癥新藥開發(fā)提供了依據(jù)[5-7]。蟲草菌素還具有抗病原微生物、抗炎、抗白血病等藥理作用。近年來，國內外研究者在蛹蟲草菌株的誘變篩選和蟲草菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化方面做了大量研究[8-9]，但蟲草菌素產量依然不高。為了提高蛹蟲草固體發(fā)酵產物中蟲草菌素產量，本研究以從青藏高原分離獲得的具有高產蟲草菌素潛力的蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌株YWCM-1為試驗菌株，探討不同添加物及添加量對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的影響，以期通過添加不同物質提高青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素的含量，為青藏高原青稞蛹蟲草發(fā)酵生產蟲草菌素的產量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]菌株YWCM-1由青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心分離保存。青稞、蠶蛹粉：市售。

1.1.2 試劑

蟲草菌素（cordycepin）標準品：美國Sigma公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鏈霉素、檸檬酸銨、瓊脂粉、麥芽糖、酵母膏等試劑均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基采用沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，瓊脂粉40g，水1 000 mL，pH自然。

改良沙氏液體培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛹蟲草固體發(fā)酵基質為破碎的青稞。營養(yǎng)液配方為葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，無水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，酵母膏5.0 g/L。基質與營養(yǎng)液的質量比為1∶1.5，初始pH自然，無色玻璃瓶容積為350 mL（內徑6.2 cm，高15 cm），以聚乙烯膜封口，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

1260安捷倫高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；DH-360A電熱恒溫光照培養(yǎng)箱：北京科偉興儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；TS-2012恒溫振蕩器：上海天呈實驗儀器制造公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZK-82A型真空干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和種子液的制備

菌種活化：將菌株YWCM-1接種于活化培養(yǎng)基上進行菌種活化，先25℃，避光培養(yǎng)5 d，再25℃連續(xù)光照（光強600 lx）培養(yǎng)1 d至菌落完全變色。

種子液制備：以50 mL無菌水洗活化后斜面上菌株孢子，制成終濃度為106個/mL的均一孢子懸液。將種子液按照體積分數(shù)5%的接種量接種于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液體培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min條件下避光培養(yǎng)4 d，制得種子液。

1.3.2 蛹蟲草固體發(fā)酵產子實體

按照10%接種量將種子液接種于添加營養(yǎng)液的青稞基質上，先25℃避光培養(yǎng)5 d，然后連續(xù)光照2 d至菌絲完全變?yōu)槌赛S色；再進行間斷光照和變溫培養(yǎng)（每天光照18 h，光強600 lx；光照培養(yǎng)溫度為25℃；避光培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)溫度為15℃）30 d后收取子實體，用于蟲草菌素檢測，每組10個平行，結果取平均值。

1.3.3 樣品蟲草菌素測定

將收獲的子實體于60℃真空干燥，粉碎；蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量通過高效液相色譜法測定[10]。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水=5∶95（V/V），用前過0.45 μm濾膜，脫氣；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

蟲草菌素含量計算公式如下：

式中：W為蟲草菌素的含量，μg/kg；A為試樣中蟲草菌素的峰面積；As為標準工作樣中蟲草菌素峰面積；ρs為標準工作液中蟲草菌素的質量濃度，μg/mL；V為試樣液最終定容體積，mL；f為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.5 不同組分種類的單因素試驗

分別以葡萄糖、蔗糖、葡萄糖/蔗糖（1∶1）代替原營養(yǎng)液中的碳源，添加量均為20 g/L；以蛋白胨、蠶蛹粉、蛋白胨/蠶蛹粉（1∶1）代替營養(yǎng)液中的氮源，添加量均為10 g/L；以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀代替原營養(yǎng)液中的磷酸鹽，添加量均為1.0 g/L，以檸檬酸銨、鏈霉素為生長因子，添加量均為1.0 g/L，培養(yǎng)基質與各添加物組成的營養(yǎng)液的質量比均為1∶1.5，以青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素含量為評價指標，對添加物種類進行篩選，按蛹蟲草固體發(fā)酵產子實體的方法進行。

1.3.6 營養(yǎng)液配方優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，以青稞蛹蟲草子實體蟲草菌素含量為評價指標，對蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素、酵母膏、硫酸鎂等6個因素進行優(yōu)化正交試驗，每個因素選擇3個水平，按L27（36）正交表設計試驗，各因素與水平見表1。

1.3.7 統(tǒng)計分析方法

本研究中所有的試驗設計和數(shù)據(jù)皆采用Minitab 16.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 碳源、氮源、磷酸鹽、生長因子的單因素試驗

以蛹蟲草固體發(fā)酵產子實體的方法，進行單因素試驗對影響青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素物質種類進行篩選，結果見圖1。

由圖1可知，不同添加物對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響各不相同。在碳源方面，當以蔗糖為唯一碳源時，其子實體中的蟲草菌素含量最高，由此可知，在以青稞為發(fā)酵基質的蛹蟲草子實體發(fā)酵中蔗糖是其產蟲草菌素的最適碳源，這與MAO X B等[9，11-12]研究結果有所出入。這可能是因為本研究是以青藏高原特有的農作物青稞為發(fā)酵基質，較其他研究者所使用的大米、玉米、高粱米等發(fā)酵基質其營養(yǎng)成分有所差別。在氮源方面，當以蠶蛹粉為唯一氮源時蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量最高，表明蠶蛹粉是青稞蛹蟲草子實體合成累積蟲草菌素的最適氮源。在磷酸鹽方面，磷酸二氫鉀比磷酸氫二鉀更有利于蛹蟲草子實體中蟲草菌素的合成累積，這與文庭池等[13]的研究結果有所不同，可能是因為在青藏高原缺氧、干燥環(huán)境中蛹蟲草對磷酸鹽的需求有所不同。在生長因子的篩選方面，鏈霉素在子實體的蟲草菌素合成累積方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，這與肖正華等[14]在其他發(fā)酵基質上的研究結果一致，這表明鏈霉素為生長因子對蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積確有促進作用。

2.2 營養(yǎng)液配方正交試驗優(yōu)化結果

單因素試驗結果表明，蔗糖、蠶蛹粉、磷酸二氫鉀、鏈霉素是影響青稞蛹蟲草子實體產蟲草菌素的顯著因子，另外文庭池等[13，15]的研究表明硫酸鎂和酵母膏對蛹蟲草產蟲草菌素也有較顯著影響，因此為了確定這6因素對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量影響，進行正交試驗，結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

由表2可知，以青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量為評價指標，各因素對子實體中蟲草菌素含量的影響程度大小依次為蔗糖＞蠶蛹粉＞硫酸鎂＞磷酸二氫鉀＞鏈霉素＞酵母膏。最佳組合為A2B2C1D3E3F2，即添加量為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此最佳配方條件下進行驗證試驗，蟲草菌素的含量為8 215 mg/kg。

由表3可知，蔗糖、蠶蛹粉對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積有極顯著（P＜0.01）的影響；磷酸二氫鉀和鏈霉素對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積有顯著（P＜0.05）的影響；而硫酸鎂和酵母膏對青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積無顯著影響。

3 結論

本研究以青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量為評價指標對碳源、氮源、無機鹽、生長因子等進行篩選，通過單因素試驗確定有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積的碳源為蔗糖、氮源為蠶蛹粉、無機鹽為磷酸二氫鉀、生長因子為鏈霉素。篩選出的有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量的物質與以往報道的有同異之處，這從一定程度上表明不同的發(fā)酵基質和發(fā)酵環(huán)境對蛹蟲草子實體中蟲草菌素的合成累積所需的物質有所影響。通過正交試驗獲得了以青稞為發(fā)酵基質有利于青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素合成累積的最佳營養(yǎng)液配方為蔗糖30 g/L，蠶蛹粉7.5 g/L，鏈霉素2.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此優(yōu)化配方條件下，青稞蛹蟲草子實體中蟲草菌素含量可達8 215 mg/kg。本研究為高原環(huán)境下青稞蛹蟲草子實體產蟲草菌素的工業(yè)化開發(fā)奠定了一定基礎。

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Effect of different additives on the production of cordycepin in the fruit body of highland barleyCordycepes militaris

HU Jiuping1,2,3,ZHAO Hui1,2,3*,ZHOU Lihong2,4,LIU Min1,2,3,CHEN Fagui1,2,3,QI Shanshan1,2,3,XIONG Yan1,2,3
(1.Tibet Yuewang Biotechnology Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China; 2.National United Engineering Research Center for Tibetan Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 3.Lhasa Highland Barley Fermentation Engineering Technology Research Center,Lhasa 850000,China; 4.Institute of Fungi Resource,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The effect of different additives and additions on cordycepin content of highland barelyCordycepes militarisfruit body was studied,and the medium formula that affect cordycepin production was optimized.Results indicated that sucrose,silkworm chrysalis meal,monopotassium phosphate and streptomycin were the optimal carbon source,nitrogen source,inorganic salt,and growth factor,respectively,which are all significantly beneficial to cordycepin sythesis and accumulation.The orthogonal experiments indicated that the effect of different substances on cordycepin content in order was sucrose,silkworm chrysalis meal,potassium dihydrogen phosphate,streptomycin,magnesium sulfate,yeast extract,respectively.The optimal addition were sucrose 30 g/L,silkworm chrysalis meal 7.5 g/L,monopotassium phosphate 1.0 g/L,streptomycin 2.0 g/L,magnesium sulfate 1.5 g/L and yeast extract 2.5 g/L,respectively.The cordycepin production in highland barelyC.militarisfruit body could reach 8 215 mg/kg at such condition.

highland barleyCordycepes militaris;fruit body;cordycepin;orthogonal experiment

Q815

A

0254-5071（2015）06-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.018

2015-05-27

拉薩市科技計劃項目（201410）

胡久平（1986-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程、微生物活性。

*通訊作者：趙輝（1969-），男，經濟師，碩士，研究方向為發(fā)酵工程、工商行政管理。