白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的提取工藝研究

程 敏，田童童，李 甜，朱新榮，張 建

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的提取工藝研究

程 敏，田童童，李 甜，朱新榮，張 建*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

以白蕓豆為原料，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑（α-AI）抑制率。在單因素的基礎(chǔ)上，選擇料液比、pH值、提取時(shí)間、提取溫度為自變量，α-AI抑制率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法，研究各自變量及其交互作用對(duì)α-AI抑制率的影響。根據(jù)預(yù)測(cè)模型得到最佳的提取工藝條件為料液比1∶30.05（g∶mL），pH值為3.6，提取時(shí)間2.66 h，提取溫度50.14℃。在此條件下得到的α-AI抑制率為95.435%。所得白蕓豆α-AI抑制率提取回歸模型高度顯著（R2=0.973），擬合性好，可用于預(yù)測(cè)白蕓豆中α-AI抑制率。

白蕓豆；提取；α-淀粉酶抑制率；響應(yīng)面分析

白蕓豆（white kidney bean）屬豆科（Leguminosae），蝶形花亞科（Papilionoideae），菜豆族菜豆屬[1]，原產(chǎn)美洲的阿根廷和墨西哥，后經(jīng)人工栽培馴化已適應(yīng)冷涼潮濕的高原地帶。白蕓豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值豐富，據(jù)分析，每100 g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白質(zhì)19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，鈣120 mg，鐵10 mg[2]。白蕓豆作為一種高鉀低鈉食品，適合于高血脂、心臟病、動(dòng)脈硬化和忌鹽患者食用。因?yàn)閮r(jià)格便宜，所以在國(guó)內(nèi)外倍受消費(fèi)者的青睞。

白蕓豆富含α-淀粉酶抑制劑和膳食纖維。α-淀粉酶（l,4-α-D-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.l）作用于淀粉時(shí)，從其分子內(nèi)部切開α-1,4糖苷鍵，生成還原糖和糊精，由于產(chǎn)物的末端殘基碳原子為α構(gòu)型，故稱為α-淀粉酶。能與α-淀粉酶分子上的相應(yīng)部位結(jié)合并引起α-淀粉酶分子構(gòu)象改變，使其催化活性降低或者喪失的化合物為α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，α-AI），屬于糖普水解酶抑制劑的一種，國(guó)外稱之為“淀粉阻斷劑（starch blocker）”。它能有效阻斷高淀粉類食物（雜糧、面食、米飯及相關(guān)糕點(diǎn)和零食）中淀粉的分解，阻斷大部分淀粉熱量的攝取，減少人體最大的脂肪來(lái)源。而且白蕓豆α-淀粉酶抑制劑經(jīng)胃腸道排出體外，不必經(jīng)過(guò)血液循環(huán)，不作用于大腦神經(jīng)中樞，食用后不腹瀉、不乏力、不厭食、體質(zhì)量不反彈、完全符合世界衛(wèi)生組織的減肥原則[3-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蕓豆：購(gòu)買于新疆石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：上海鹽季生物有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；鹽酸（分析純）：北京化工廠；可溶性淀粉（分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠；葡萄糖（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；丙三醇（分析純）：天津永晟精細(xì)化工有限公司；α-淀粉酶（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Multifuge X3高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Heraeus公司；RHP-600高速多功能粉碎機(jī)：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；EPED-20TJ超純水器：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；ZXRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；85-1磁力攪拌器、DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；JM-B10002電子天平：諸暨市超澤橫器設(shè)備有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將市場(chǎng)上購(gòu)買的白蕓豆去除雜質(zhì)，在4℃水中浸泡12 h后去皮，在35℃烘箱中干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩得白蕓豆種子粉末。經(jīng)過(guò)上述處理的樣品裝入聚乙烯袋中在4℃冰箱內(nèi)保藏備用。

1.3.2 α-淀粉酶抑制劑的提取

稱取5 g的樣品，按照一定料液比加入蒸餾水，在恒定的溫度下不斷的攪拌使其充分溶解。通過(guò)加入0.5 mol/L NaOH或0.5 mol/L HCl來(lái)調(diào)節(jié)水解液的pH值。然后將水解液于10 000 r/min的條件下離心20 min，合并上清液。并且用DNS比色法[7-10]測(cè)定其中還原糖的含量。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6只試管依次加入0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（3 mg/mL），制成質(zhì)量濃度依次遞增的系列標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，充分混勻后加入2 mL DNS試劑，于沸水浴中反應(yīng)5 min。流水冷卻，各管定容至25 mL。以管1為空白對(duì)照，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)各管的吸光度值。

1.3.4 樣品測(cè)定

參考趙蓉等[11-12]的方法。樣品管：精確吸取0.5 mL從白蕓豆提取的α-AI和0.5 mLα-淀粉酶溶液，充分混勻，在37℃水浴反應(yīng)10 min，然后加入1 mL 2%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，之后，再加入2 mL DNS顯色劑，在沸水浴中反應(yīng)5 min，之后立即用流動(dòng)自來(lái)水冷卻（終止反應(yīng)），適量稀釋，在波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定吸光度值，記為OD470nm。對(duì)照管：用蒸餾水替代α-AI，其他條件同上，記為OD′470nm。空白管：用蒸餾水替代α-AI和α-淀粉酶，其他條件同上，調(diào)零。α-淀粉酶抑制劑抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：OD470nm為樣品管的吸光度值，OD′470nm為對(duì)照管的吸光度值。

1.3.5 提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)[13]

準(zhǔn)確稱取20份5g白蕓豆粉，分別按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）加蒸餾水，調(diào)溶液pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分別在20℃、35℃、50℃、65℃、80℃水浴條件下攪拌浸提1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h。粗提液倒入離心管中，于離心機(jī)中4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液，測(cè)定α-淀粉酶抑制劑抑制率，考察料液比、pH值、提取時(shí)間及溫度對(duì)α-AI抑制率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken，以料液比（A），pH值（B），提取時(shí)間（C），提取溫度（D）為主要影響因素，以α-AI抑制率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，所有的試驗(yàn)隨機(jī)進(jìn)行，每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼如表1所示。每個(gè)因素被編碼為3個(gè)水平（-1，0，1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.349 9x-0.018 8，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 1，表明葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度值在0.6～3.0 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)α-淀粉酶抑制劑抑制率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，提取液中α-AI抑制率先增大，后減小。在料液比1∶30（g∶mL）時(shí)α-AI抑制率達(dá)到峰值，之后α-AI抑制率卻有所降低，究其原因可能是由于料液比的增加，活性物質(zhì)在兩相中濃度差增大，活性物質(zhì)溶出增加，α-AI抑制率增加，但隨著活性物質(zhì)溶出達(dá)到平衡，料液比繼續(xù)增加，活性物質(zhì)在提取液中的濃度被稀釋而降低，從而導(dǎo)致提取液α-AI值降低。因此提取料液比在1∶30（g∶mL）適宜。

2.2.2 不同pH值對(duì)α-淀粉酶抑制劑抑制率的影響

由圖3可知，隨著pH值的增加，提取液中α-AI抑制率一直減小，在pH值為3時(shí)，α-AI抑制率達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)樗嵝越嵯陆咏?淀粉酶抑制劑的等電點(diǎn)，更容易使蛋白充分溶出，能除掉較多的雜蛋白，使浸提液澄清；隨著堿性的增強(qiáng)，造成了部分蛋白的損失，所以抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故pH值選擇為3.0適宜。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)α-淀粉酶抑制劑抑制率的影響

由圖4可知，隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率先上升后平穩(wěn)，時(shí)間＞2.5 h后抑制率增加幅度不明顯。說(shuō)明隨著時(shí)間的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的溶出率逐漸趨于穩(wěn)定，活性成分在細(xì)胞內(nèi)外濃度逐漸達(dá)到平衡。從提取提效果和實(shí)驗(yàn)周期2方面考慮，浸提時(shí)間選擇在2.5 h比較合適。

2.2.4 浸提溫度對(duì)α-淀粉酶抑制劑抑制率的影響

由圖5可知，溫度對(duì)提取液α-淀粉酶抑制劑抑制率的影響較大，當(dāng)溫度在20～50℃時(shí)，抑制效果增高明顯，50℃時(shí)抑制效果達(dá)到最大值；從50～80℃，抑制率有所下降。這說(shuō)明適度的增加提取液的溫度可以提高抑制效果，但加熱浸提過(guò)程中當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致部分α-淀粉酶抑制劑結(jié)構(gòu)改變，α-AI活性成分會(huì)部分失活，因此提取溫度為50℃較合適。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑制率為（Y）為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，以料液比（A），pH值（B），提取時(shí)間（C），提取溫度（D）為主要影響因素，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。對(duì)該回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

運(yùn)用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，擬合所得白蕓豆α-AI抑制率（Y）的多元二次回歸方程如下：

由表3可知，模型的F值為48.33，P＜0.000 1，說(shuō)明該模型極顯著，可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取參數(shù)。失擬項(xiàng)在0.05水平上不顯著（P=0.065 2），說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起。模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.945 9，說(shuō)明模型能解釋94.59%響應(yīng)值的變化；模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為R2=0.973 0，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合較好，故適用于提取工藝條件的預(yù)測(cè)。其中模擬一次項(xiàng)B、C項(xiàng)、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2項(xiàng)及交互項(xiàng)AB、BC項(xiàng)對(duì)白蕓豆α-AI抑制率有極顯著影響，而AD對(duì)白蕓豆α-AI抑制率值有顯著影響，其他因素影響不顯著。

2.3.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析（response surface analysis，RSM）法按照參考文獻(xiàn)[14]采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將多因子試驗(yàn)中因子與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，當(dāng)?shù)玫降那孑^為平緩，等高線密度較為稀疏，則各個(gè)試驗(yàn)變量對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性很小；當(dāng)曲面較陡，等高線密度較大，證明該條件下的各個(gè)變量對(duì)試驗(yàn)的響應(yīng)值影響比較顯著，試驗(yàn)的響應(yīng)面及等高線見圖6。

由圖6可知，隨著各因素水平的升高或延長(zhǎng)，α-AI抑制率先增加后減少。根據(jù)圖6A、6B、6C的曲面圖的陡峭程度顯示，可得出料液比對(duì)提取率的影響要小于pH和提取時(shí)間，但大于提取溫度；同理，圖6D、6E的曲面圖顯示pH對(duì)α-AI抑制率的影響要弱于提取時(shí)間，強(qiáng)于提取溫度；圖6F響應(yīng)面圖顯示提取時(shí)間對(duì)α-AI抑制率的要大于提取溫度。再次驗(yàn)證了單因素與交互作項(xiàng)對(duì)α-AI抑制率的影響的主次順序。

通過(guò)響應(yīng)面軟件的優(yōu)化程序模塊對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如下：料液比1∶30.056（g∶mL），提取時(shí)間2.66 h，pH值為3.6和溫度50.14℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)α-AI抑制率可達(dá)到95.435%。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

實(shí)際操作過(guò)程中選擇料液比1∶30（g∶mL），提取時(shí)間2.7 h，pH值為3.6和溫度50℃，進(jìn)行3次試驗(yàn)，得到的α-AI抑制率的平均值為（94.9±0.656）%。結(jié)果表明，模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值相對(duì)偏差較小，說(shuō)明本試驗(yàn)所選模型具有很高的擬合性，該模型能較好的預(yù)測(cè)白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的抑制率，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐[15-16]。

3 結(jié)論

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，選用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑最佳條件為料液比1∶30.056（g∶mL），提取時(shí)間2.66h，pH值為3.6和溫度50.14℃，該條件下經(jīng)模型預(yù)測(cè)得到的α-AI抑制率為95.435%，實(shí)際試驗(yàn)值為（94.9±0.656）%，與預(yù)測(cè)值基本一致。

[1]李鋒，王競(jìng)，趙曉軍，等.小白蕓豆凝集素的分離純化及性質(zhì)研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2010，42（1）：120-124.

[2]JLEE S C.The structure of naturally-occurringα-amylase inhibitors[C]. Food of 21st Century-Food and Resource,technology,environment(II), 2000:8-27.

[3]魏鵬娟，王魯峰，徐曉云，等.α-淀粉酶蛋白類抑制劑的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：312-318.

[4]趙蓉，李多偉，沈曉東，等.白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑的研究[J].中成藥，2008，30（9）：1355-1357.

[5]呂鳳霞，陸兆新.α-淀粉酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2002，23（3）：152-155.

[6]張曉琦，楊明琰，馬瑜，等.白豆α-淀粉酶抑制劑糖蛋白的提取純化及降血糖活性研究[J].藥物生物技術(shù)，2007，14（6）：406-410.

[7]王文蒙，李楠，王玲玲，等.小麥麩皮中α-淀粉酶抑制劑的分離、純化及性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（11）：28-31.

[8]趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J].食品科技，2008，29（8）：534-536.

[9]王紅英，錢斯日古愣，趙前程，等.3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定麥冬多糖含量[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（5）：628-630.

[10]齊香君，茍金霞，韓戍珺，等.3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定溶液中還原糖的研究[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2004，12（3）：18-30.

[11]趙蓉，李多偉，任濤，等.DNS比色法測(cè)定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑活性的方法研究[J].中成藥，2013，35（3）：573-576.

[12]楊明琰，宋紀(jì)蓉，張曉琦，等.白豆α-淀粉酶抑制劑糖蛋白的提純及性質(zhì)研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，37（5）：753-757.

[13]賈光鋒，趙晨，陸文總，等.超聲波輔助提取白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的研究[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（16）：39-42.

[14]許云青，龍盛京.響應(yīng)面分析法對(duì)α-淀粉酶抑制劑篩選方法的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（22）：169-173.

[15]史光輝，胡志和，馬科銘，等.紫薯花青素提取條件優(yōu)化及淀粉等產(chǎn)物的制備[J].食品科學(xué)，2014，35（22）：39-45.

[16]董紅敏，牛小勇，劉繼，等.響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化川明參總香豆素超聲輔助提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2014，35（24）：285-289，293.

Extraction technology of α-amylase inhibitor from white kidney bean

CHENG Min,TIAN Tongtong,LI Tian,ZHU Xinrong,ZHANG Jian*
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Using white kidney bean as material,theα-amylase(α-AI)inhibition activity in white kidney bean was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)colorimetry.Based on single factor experiment,the interaction effect of solid-liquid ratio,pH,extraction time,and temperature onα-AI rate were optimized using response surface methodology.The optimum extraction conditions were as follows:solid-liquid ratio 1∶30.05(g∶ml),pH 3.6,time 2.66 h,temperature 50.14℃based on the prediction model.Under these conditions,theα-AI rate of extraction solution was 95.435%.The established regression model were highly significant(R2=0.973),which can be used for the prediction ofα-AI rate in white kidney bean.

white kidney bean;extraction;α-amylase inhibition rate;response surface analysis

Q51

A

0254-5071（2015）06-0089-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.020

2015-05-25

石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)項(xiàng)目（3152SPXY01027）

程敏（1992-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

*通訊作者：張建（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。