一株產β-葡萄糖苷酶煙曲霉菌株的鑒定及其產酶特性

劉德海，馬 煥，解復紅，權淑靜，賈 彬，王紅云，陳國參

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南鄭州450008）

一株產β-葡萄糖苷酶煙曲霉菌株的鑒定及其產酶特性

劉德海1，馬 煥2，解復紅2，權淑靜2，賈 彬2，王紅云1，陳國參1

（1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業酶工程技術研究中心，河南鄭州450008）

從釀造大曲中分離篩選出一株產β-葡萄糖苷酶真菌菌株L1，根據對該菌株形態學觀察和分子生物學18S rDNA分析，將其鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigates)，并對其所產β-葡萄糖苷酶酶學性質進行了研究。結果表明，該酶的最適反應溫度為50℃，熱穩定性較好，在50℃保溫120 min仍能保持79.6%酶活性；最適反應pH值為4.0，在pH值3.0～5.0酶活性穩定。

煙曲霉；β-葡萄糖苷酶；分離鑒定；酶學性質

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶的成分之一，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶，它能夠作用于纖維二糖或纖維寡糖，使其水解為葡萄糖分子[1]。木質纖維素原料是自然界最豐富的可再生資源，也是主要的農業廢棄物，β-葡萄糖苷酶在木質纖維素降解中起到關鍵作用，但其含量少、活力低，成為木質纖維素降解的瓶頸[2]。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是一種自然界普遍存在的通過空氣傳播的的腐生真菌，能夠引起食品腐敗，但是煙曲霉能夠分泌產生多種有用的酶類，能夠產生幾丁質酶、植酸酶[3]、殼聚糖酶[4]、纖維素酶[5]、淀粉酶[6]等，在酶工程領域有諸多應用，煙曲霉功能基因較多，煙曲霉包括一些編碼酶類的基因、幾丁質合成酶的基因、植酸酶合成基因等，梁東春等[7]根據GenBank中發布的煙曲霉菌殼聚糖酶（EC3.2.1.132）基因序列人工合成8條DNA長鏈及4條引物鏈，并成功在大腸桿菌中表達，所得重組殼聚糖酶具有降解殼聚糖的生物活性，王穎等[8]從煙曲霉中克隆114 kb的cDNA片段，編碼一個氨基酸蛋白，序列分析表明該蛋白與其它真菌來源的幾丁質酶同源；王嚴等[9]以自行篩選的煙曲霉WY-1為出發菌株，通過PCR方法克隆其植酸酶基因，并構建了含有植物信號肽序列的植酸酶基因植物表達載體。

本研究從釀造酒曲中分離篩選出一株產β-葡萄糖苷酶菌株L1，通過生物形態學觀察及分子生物學18S rDNA分析，鑒定該菌株為曲霉屬（Aspergillus）煙曲霉（Aspergillus fumigatus），并對其產β-葡萄糖苷酶酶學性質進行了研究，以期為構建β-葡萄糖苷酶工程菌株及高效表達打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

釀造磚曲：河南省王勿橋醋業有限公司。

1.1.2 培養基[10]

菌種保藏培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL；

菌種篩選分離培養基：（NH4）2SO44.0 g，NaCl 2.0 g，CaCO34.0 g，KH2PO41.0 g，纖維二糖5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，加入適量鏈霉素；

菌種篩選透明圈培養基：羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）2.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，鏈霉素適量；

液體搖瓶發酵產酶培養基：麩皮2 g，（NH4）2SO40.4 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，CaCl20.05 g，蒸餾水100 mL。

1.1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：寶生物工程大連有限公司；瓊脂糖：法國Biowest公司；MarkerⅢ：上海萊楓生物科技有限公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）：天津科密歐公司；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glu copyranoside，p-NPG）、羧甲基纖維素鈉：美國Sigma公司；纖維二糖：美國Amresco公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DRP-9052型電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；PHSJ-3F酸度計：瑞士Mettle Toledo公司；YP2102電子天平：上海光正醫療儀器有限公司、T-Gradient Thermoblock PCR擴增儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法[11-12]

無菌操作條件下，取釀造磚曲1.0 g，置于盛有99 mL無菌蒸餾水三角瓶中，100 r/min往復振蕩15 min，制成10-2菌液，將10-2菌液稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度菌液，按常規方法涂布分離培養，分別接入菌種篩選分離培養基平板上，挑取長出的單菌落，轉接入PDA培養基試管斜面，觀察得到的單菌落形態及外觀，選擇疑似煙曲霉菌株，接入菌種篩選透明圈培養基平板上，采用透明圈法對菌株進行第二次篩選，觀察有無透明圈及透明圈大小，挑取能夠在纖維二糖固體分離培養基平板上生長，且在菌種篩選透明圈培養基平板上有明顯透明圈的的菌種，轉接入PDA培養基試管斜面進行保藏。

1.3.2 液體搖瓶發酵產酶試驗

液體搖瓶發酵產酶培養基進行產酶試驗，250 mL三角瓶，液體發酵產酶培養基100 mL，每三角瓶接種試管斜面菌種2～3環，培養條件為30℃，轉速180 r/min的搖瓶培養3 d后，進行β-葡萄糖苷酶酶活力檢測分析。

1.3.3 粗酶液的提取

發酵液經四層紗布過濾，10000r/min離心分離10min，上清液即為粗酶液，置4℃冰箱保存備用。

1.3.4 酶活力的測定

采用對硝基苯酚法測定酶活[13]：取0.1 mL的待測酶液加入到5 mmol/L p-NPG溶液0.2 mL和pH值為5.0的醋酸緩沖液0.7 mL，于45℃恒溫反應30 min后，立即加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2.0 mL終止反應，再加入9.0 mL蒸餾水，于波長400 nm處測定吸光度值。

β-葡萄糖苷酶酶活力定義：在上述反應條件下，以1min內催化生成1 μmol p-NP所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

相對酶活測定：檢測粗酶液的酶活力，以測得的酶活性最大值作為100%，其他的酶活為實際酶活除以最大酶活的百分數。其計算公式如下：

1.3.5 菌種的鑒定

菌種的形態生物學鑒定根據文獻[14]，分子生物學鑒定根據文獻[15]的方法對分離的菌種進行鑒定。

真菌DNA的提取按照試劑盒說明書進行得到基因。

采用真菌18SrDNA基因測序通用引物，上游引物ITS1：5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′和下游引物ITS4：5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′。

PCR反應體系（50 μL）：dd H2O 37.0 μL；10×Buffer 5.0μL；dNTP2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；TaqDNA聚合酶0.6 μL；真菌模板基因組DNA 1 μL。

PCR擴增條件：94℃預復性4 min，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸60 s，30個循環，72℃延伸10 min。

PCR反應產物經1%瓊脂糖（Biowest）凝膠檢測后送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序分析，測序結果序列，登陸NCBI上提交Genbank數據庫進行BLAST同源性序列比對分析。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶酶學性質

最適反應溫度：將底物p-NPG溶液分別在不同水浴溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保溫5 min，再加入經適當稀釋0.1 mL的待測酶液，在不同溫度下與底物進行酶促反應，在pH值為5.0的醋酸緩沖液條件下按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，確定β-葡萄糖苷酶最適反應溫度。

最適作用pH：配制不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸緩沖液，將適當稀釋的酶液與底物p-NPG在相同溫度45℃，不同pH緩沖液下酶促反應，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以pH值為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，確定β-葡萄糖苷酶最適作用pH。

熱穩定性：將適當稀釋的粗酶液分別在50℃水浴條件下保溫0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，立即冰浴冷卻后取樣，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以溫度為橫坐標，保溫處理后酶液殘余相對酶活力為縱坐標作圖，考察溫度對酶活力的影響。

pH穩定性：分別用不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸緩沖液配制酶液，在45℃保溫30 min，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以pH值為橫坐標，相對酶活力為縱坐標作圖，考察pH值對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 產β-葡萄糖苷酶菌種的篩選

涂布平板法分離純化：以纖維二糖為唯一碳源，按常規方法采用菌種篩選分離培養基平板涂布分離培養，通過對釀造大曲中分離β-葡萄糖苷酶產生菌的純化培養，共分離得到15株菌株，根據文獻[14]魏景超《真菌鑒定手冊》觀察得到的單菌落形態及外觀，選擇出疑似煙曲霉菌株3株，分別接入篩選透明圈培養基平板上進行二次篩選和液體發酵產酶試驗，其結果見表1。由表1可知，L1菌株透明圈直徑與菌落直徑之比（H/C值）較大，產β-葡萄糖苷酶達到0.65U/mL，所測酶活力較高。故選擇L1菌株進行分子生物學鑒定。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 菌株L1的形態特征

菌株L1在PDA培養基上培養3d后，其菌落特征見圖1。

由圖1可知，菌落中心稍凸起，初形成白色、圓形，絨毛狀菌落，菌落反面淺黃綠色，顯微觀察可見，菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑不分支，呈深淺不同的綠色，分生孢子穗圓筒形帶綠色，分生孢子串生于小梗上，分生孢子球形或近球形，粗糙，綠色，頂囊膨大，分布在有隔扳的縱橫交錯的氣生菌絲上。根據以上特征，對照魏景超《真菌鑒定手冊》及相關文獻報道，初步將L1菌株鑒定為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi imperfecti），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.2.2 菌株L1的分子生物學鑒定

以提取的L1菌株DNA作為模板，采用引物ITS1：5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTAT TGAT ATGC-3′進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，經PCR擴增后，根據與上海萊楓生物科技有限公司MarkerⅢ對照，得到了一個近600 bp大小的DNA片段。經測序后，得到完整的18S rDNA的基因序列，其測序序列片段長度為573 bp，具體序列見圖3，將測序結果基因序列提交到GenBank核酸序列數據庫中與已有的相關同源序列BLAST比對分析，結果表明，L1菌株18S rDNA基因序列與GenBank中已有的煙曲霉菌（Aspergillusfumigatus）相似性在99%，親緣關系最近，其相似性、同源性分析見表2，并在18S rDNA基因序列同源性基礎上構建系統發育樹，見圖4，結合形態學觀察，表明菌株L1為曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.3 菌株L1產β-葡萄糖苷酶酶學性質

2.3.1 最適反應溫度

將菌株L1產β-葡萄糖苷酶在不同溫度下（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）與底物反應，考察溫度對酶活的影響，結果如圖5。由圖5可知，菌株L1產β-葡萄糖苷酶酶促反應的最適溫度為50℃。

2.3.2 最適反應pH值

將菌株L1產β-葡萄糖苷酶在相同溫度45℃，不同pH值條件下（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）與底物反應，考察pH值對酶活的影響，結果見圖6。由圖6可知，β-葡萄糖苷酶酶促反應的最適pH值為4.0。

2.3.3 酶的熱穩定性

將菌株L1產β-葡萄糖苷酶在最適反應溫度（50℃）條件下，保溫不同時間0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min之后，考察酶的熱穩定性，結果如圖7。由圖7可知，50℃條件下，β-葡萄糖苷酶在保溫120 min時酶活性為79.6%，說明該酶有較好的熱穩定性。

2.3.4 pH穩定性

將菌株L1產β-葡萄糖苷酶適當稀釋的酶液分別在pH值1.0～7.0條件下保溫處理30 min之后，考察酶的pH穩定性，結果如圖8。從圖8可以看出，β-葡萄糖苷酶的酶活性在pH值3.0～5.0之間穩定。

3 結論

馬旭光等[16]對航天誘變菌株黑曲霉菌株產β-葡萄糖苷酶酶學特性進行了研究：該酶最適溫度為55℃，55℃保溫2 h酶活力保持95%以上；最適反應pH值為5.5，pH在3.0～6.0時酶活力穩定性良好。覃擁靈等[17]對產β-葡萄糖苷酶野生真菌芽枝霉菌產β-葡萄糖苷酶酶學性質進行了研究，結果顯示，該酶在pH 4.0～9.0范圍內，60℃以下酶活力穩定。鄭芳等[18]分離篩選出一株高產β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌，其產β-葡萄糖苷酶最適反應pH值和溫度分別為7.0和40℃。

本研究從釀造用酒曲中分離篩選出產β-葡萄糖苷酶的菌株，經過菌種篩選分離培養基、菌種篩選透明圈培養基篩選出一株產β-葡萄糖苷酶菌株L1，對L1其進行形態學觀察及分子生物學鑒定，將其鑒定為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi imperfecti），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus），并對菌株L1發酵所產β-葡萄糖苷酶酶學性質進行了研究，其最適反應溫度為50℃，熱穩定性較好，50℃保溫120 min仍能保持79.6%酶活性；最適反應pH值為4.0，在pH值3.0～5.0之間酶活性穩定。

[1]唐開宇，張全，佟明友.β-葡萄糖苷酶發酵技術的進展[J].纖維素科學與技術，2009，17（3）：65-70.

[2]石彩蕊，王義強，陳介南，等.產β-葡萄糖苷酶微生物育種研究進展[J].生物技術通報，2011，27（3）：59-65.

[3]張海濤，周東群，劉新利.煙曲霉的酶工程應用研究進展[J].江西飼料，2010，114（2）：1-5.

[4]周桂，何子平，禤金彩.煙曲霉產殼聚糖酶液體發酵條件研究[J].海洋科學，2006，30（2）：34-37.

[5]金偉，陳文靜，姚斌，等.一株產纖維素酶的耐熱煙曲霉篩選及產酶條件研究[J].中國釀造，2012，31（6）：61-64.

[6]司美茹，薛泉宏，蔡艷.混合發酵對纖維素酶和淀粉酶活性的影響[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2002，30（5）：69-74.

[7]梁東春，左愛軍，郭剛，等.煙曲霉菌殼聚糖酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].微生物學報，2005，45（4）：539-542.

[8]王穎，王俊琦，胡紅焱，等.煙曲霉幾丁質酶基因的克隆與表達[J].生物工程學報，2004，20（6）：843-849.

[9]王嚴，高曉蓉，蘇喬，等.煙曲霉WY-1植酸酶基因的克隆及其在煙草中的表達[J].安徽農業科學，2007，35（7）：1923-1924，1931.

[10]張冬冬，劉新育，徐新慧，等.β-葡萄糖苷酶高產菌株的篩選及其性質研究[J].河南農業大學學報，2012，46（2）：173-176.

[11]吳坤，張世敏.微生物學實驗技術[M].北京：氣象出版社，2004.

[12]陳國參，劉德海，解復紅，等.一株產復合酶真菌菌株的篩選、鑒定及發酵產酶研究[J].中國釀造，2012，31（9）：70-74.

[13]YANNIK G,PATRICK C,STEPHANE P,et al.Enhancement of aromatic quality of Muscat wine by the use of immobilized β-glucosidase [J].J Biotechnol,1997,55(3):151-156.

[14]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?979.

[15]劉德海，郝益民，岳丹丹，等.一株產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及酶學性質研究[J].中國釀造，2013，32（6）：47-51.

[16]馬旭光，張宗舟，柳蕓，等.航天誘變菌株黑曲霉ZM-8發酵玉米秸稈產β-葡萄糖苷酶的條件優化及其酶學特性[J].中國飼料，2012，462（10）：14-17.

[17]覃擁靈，何海燕，劉園園，等.產β-葡萄糖苷酶野生真菌的篩選鑒定及酶學性質研究[J].中國釀造，2012，31（3）：53-57.

[18]鄭芳，曹小芳，張亞玲，等.一株β-葡萄糖苷酶產生菌株的分離鑒定及酶學性質研究[J].微生物學通報，2012，39（8）：1059-1068.

Identification of β-glucosidase producingAspergillus fumigatusand its enzyme production characteristics

LIU Dehai1,MA Huan2,XIE Fuhong2,QUAN Shujing2,JIA Bin2,WANG Hongyun1,CHEN Guocan1
(1.Henan Academy of Science Institute of Biology,Limited Liability Company,Zhengzhou 450008,China; 2.Henan Engineering Research Center of Industrial enzymes,Zhengzhou 450008,China)

A β-glucosidase producing strain L1 was screened from Daqu.By physical characterization and 18S rDNA molecular identification,the strain L1 was identified asAspergillus fumigatus.The enzymatic characteristics of β-glucosidase were studied as well,and the results showed that the optimum reaction temperature and pH were 50℃and 4.0.After incubation at 50℃for 120 min,it remained 79.6%of its activity.The enzyme was stable in the range of pH 3.0-5.0.

Aspergillus fumigatus;β-glucosidase;isolation and identification;enzyme activity

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.026

2015-06-03

河南省中國科學院成果轉移轉化中心項目（2014308）；河南省工程技術研究中心專項資金項目（132102213112）

劉德海（1970-），男，研究員，本科，主要從事酶工程研究工作。