南酸棗皮中酚類化合物體外模擬消化與溶劑提取的比較研究

李 俶，翟宇鑫，陳 軍,*，王謝祎，劉繼延，程 超，劉成梅

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西齊云山食品有限公司，江西 贛州 341000）

南酸棗又名五眼果，是蒙藥習用藥材[1]。劉曉庚等[2]通過測定南酸棗果實中的營養成分發現，其含有豐富的單寧、皂苷、黃酮、多酚等生物活性成分。其中多酚類化合物是一種具有顯著抗氧化性、抗腫瘤、抗炎癥等作用的營養物質，近幾年對其來源、功能性質的研究越來越受到關注[3]。目前，有關植物中多酚類化合物的研究比較活躍，主要集中于多酚類化合物提取研究方面[4-6]。然而伴隨著日常飲食攝入，食品中的多酚類化合物在體內能否充分釋放，并為人體利用進而發揮其各種功能，則需要進一步研究其在體內的消化、代謝和利用[7-8]。然而，體內消化研究面臨著復雜度高和道德倫理兩大難題，而體外模擬胃腸液消化實驗具有簡單、快速、成本低、重復性較高等優點，可用于替代體內消化實驗而被廣泛應用[9-10]。袁春龍等[11]利用體外實驗發現葡萄籽多酚類化合物的消化主要發生在胃中。江慎華等[12]發現人工胃液處理后，丁香有效部位抗氧化活性得到顯著提高，而人工腸液處理后，其抗氧化活性卻顯著降低。

近幾年，隨著江西齊云山食品有限公司對南酸棗系列產品的開發，使得綜合利用富含多酚類化合物的南酸棗皮及工業化生產變得日益重要。本實驗通過體外模擬胃腸液消化環境與溶劑提取相比較，考察不同處理方式對南酸棗皮中總多酚、總黃酮、原花青素釋放的影響，以期為南酸棗皮類產品的開發利用提供科學依據，提高南酸棗皮的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南酸棗皮，由江西齊云山食品有限公司提供。

沒食子酸標準品（純度＞99.9%）、牛膽鹽 上海晶純實業有限公司；兒茶素標準品、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；MD44透析袋 北京Solarbio公司；乙醇、鹽酸、甲醇為分析純 天津市永大化學試劑有限公司；Folin-酚試劑 上海藍季科技發展有限公司；無水Na2CO3、NaCl、NaHCO3、AlCl3、NaOH、NaNO2、C8H8O3（香草醛）均為分析純 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SHB-3型循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；HH-4型恒溫數顯水浴鍋 金壇市城西曉陽電子儀器廠；AR1140型分析天平 美國Oahus公司；DFY-500型植物粉碎機 大德藥劑有限公司；分樣篩 思科儀器紗篩廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

南酸棗去肉取皮，洗凈，50℃條件下烘干，粉碎過100 目篩，20℃條件下保存待分析。

1.3.2 人工胃液制備[13]

分別于兩個100 mL具塞錐形瓶中加入9 mg/mL NaCl溶液25 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液4 mL、4 mg/mL胃蛋白酶溶液4 mL（用0.1 mol/L鹽酸配制），混合均勻后，調pH值為2～2.5。各加入1.000 0 g樣品，于37℃、100 r/min水浴振蕩1 h。一份過濾得上清液后于－20℃條件下保存待分析，另一份繼續進行腸液消化。

1.3.3 人工腸液透析

將透析袋用9 mg/mL NaCl溶液內外清洗干凈，一端用棉線系緊，加入 9 mg/mL NaCl溶液8 mL，0.5 mol/L NaHCO3溶液2 mL，后系緊另一端，放入上述胃消化液中，于37℃、100 r/min水浴振蕩45 min，通過透析袋的選擇透過性，緩慢改變消化液pH值，該過程是在模擬食物從胃部向腸道的過渡階段。

此時，具塞錐形瓶中液體pH值為6.5～7.0附近，于透析袋外加入18 mL胰液膽汁混合液（0.2 mg/mL胰液，1.2 mg/mL膽汁），于37℃、100 r/min水浴振蕩2 h，取出透析袋，將透析袋內液體于－20℃條件下保存待分析，具塞錐形瓶中液體過濾得上清液，后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.4 生物利用率測定[14]

生物利用率是指從食物中釋放出來，在小腸壁的阻礙及選擇透過作用下，可進入血液被人體吸收利用的營養物質占食入食物總量的比例。按照公式（1）計算各成分的生物利用率。

式中：C透析為該成分在透析袋內的含量/（mg/g）；C非透析為該成分在腸道內的總含量/（mg/g）。

1.3.5 溶劑提取方法

1.3.5.1 傳統熱水浸提法[15]

精確稱取1.000 0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，于90℃水浴鍋中回流提取60 min，過濾，重復上述過程3次，合并濾液定容于250 mL，后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.5.2 超聲波輔助乙醇提取法[16]

精確稱取1.000 0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入體積分數52%乙醇溶液30 mL，超聲波提取40 min，過濾，重復上述過程3次，合并濾液定容于250 mL后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.6 Folin-酚法測定總多酚釋放量1.3.6.1 標準曲線的繪制

精密稱量1.000 0 g沒食子酸，用5 mL乙醇溶解，加水定容至50 mL，分別移取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL到50 mL容量瓶中，用水定容。從上述不同質量濃度的標準溶液中分別移取1 mL加入到50 mL容量瓶中，再分別加入30 mL蒸餾水，混合后加入2.5 mL Folin-酚試劑，混合后在5～8 min內加入7.5% Na2CO3溶液2 mL，混合后加水定容。用上述方法制備空白試樣，將上述標準溶液和空白試樣在20℃條件下避光放置2 h后，在760 nm波長處測定吸光度。以標準樣品質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，線性方程為y=0.780 7x+0.073 7（R2=0.999 3）。

1.3.6.2 樣品總多酚釋放量測定

準確移取1 mL提取液于50 mL容量瓶中，按照1.3.6.1節方法進行操作，在760 nm波長處測定吸光度，并根據回歸方程，按照公式（2）計算提取液中總多酚釋放量（以沒食子酸當量計）。

式中：ρ1為提取液中總多酚釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質量/g。

1.3.7 NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法測定總黃酮釋放量

1.3.7.1 標準曲線的繪制

準確吸取1 mg/mL兒茶素對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL比色管中，用水定容。從上述不同質量濃度的標準溶液中分別移取1 mL加入到10 mL比色管中，加入適量蒸餾水，先加5 g/100 mL NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10 g/100 mL AlCl3溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，加4 g/100 mL NaOH溶液3 mL，用蒸餾水定容到10 mL，搖勻放置15 min，以試劑空白為參比，于510 nm波長處測定吸光度，以兒茶素對照品溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，線性方程為 y=3.116 9x－0.065 6（R2=0.999 8）。

1.3.7.2 樣品總黃酮釋放量測定

精密吸取1 mL提取液置于10 mL比色管中，按照1.3.7.1節方法進行操作，于510 nm波長處測定吸光度，并根據回歸方程，按照公式（3）計算提取液中總黃酮的釋放量（以兒茶素當量計）。

式中：ρ1為提取液中總黃酮釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質量/g。

1.3.8 香草醛-甲醇-鹽酸顯色法測定原花青素釋放量[17]

1.3.8.1 標準曲線的繪制

精密稱量0.100 0 g兒茶素，加甲醇定容至100 mL，分別移取4、5、6、7、8、9 mL分別置于10 mL比色管中，用甲醇定容。從上述不同質量濃度的標準溶液中分別移取1 mL加入到10 mL比色管中，加入4 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液6 mL混勻，加入濃鹽酸3 mL混勻，30℃條件下避光靜置10 min。用紫外分光光度計在500 nm波長處測定吸光度。以甲醇空白為參比，以兒茶素對照品溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，線性方程為y=2.093 6x+0.046 1（R2=0.996 3）。

1.3.8.2 樣品原花青素釋放量測定

精密吸取1 mL提取液置于10 mL比色管中，按照1.3.8.1 節方法進行操作，于500 nm 波長處測定吸光度，并根據回歸方程，按照公式（4）計算提取液中原花青素的釋放量（以兒茶素當量計）。

式中：ρ1為提取液中原花青素釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質量/g。

2 結果與分析

2.1 南酸棗皮中總多酚的釋放情況

圖1 南酸棗皮總多酚的釋放量Fig.1 Amount of total polyphenols in Choerospondias axillaris fruit peels

由圖1可知，南酸棗皮總多酚在模擬胃、腸液中的釋放呈增加趨勢。在模擬胃液的釋放量為73.72 mg/g；在模擬腸液中消化后釋放量增加10.29 mg/g，在模擬胃液中的釋放量占模擬胃腸液總釋放量的87.75%。可以看出酚類化合物主要在胃部消化釋放。研究發現，胃、腸道消化環境較為復雜，蛋白質、碳水化合物等大分子物質易與多酚類化合物發生結合，形成結合態多酚，并且不同的pH值環境對多酚類化合物影響不同。在胃、腸道消化酶的作用下，結合態多酚化合物隨大分子物質水解而分離釋放；但胃腸道具有不同的pH值環境，胃液pH值較低呈強酸性，多酚類化合物在酸性環境中結構穩定，而腸道pH值偏堿性，消化液中的多酚類化合物在該環境下易發生聚合或降解，多酚類化合物種類的差異決定了其在消化過程中量變或質變的不同[18-22]。

溶劑提取結果表明，傳統熱水浸提得總多酚釋放量為123.76 mg/g，是超聲波輔助乙醇提取總多酚釋放量的88.62%。模擬胃腸液中的總多酚釋放量顯著低于溶劑提取的總多酚釋放量，分別為傳統熱水浸提和超聲波輔助乙醇提取總多酚釋放量的67.88%、60.16%。由于棗皮中含有豐富的膳食纖維，蛋白酶無法破壞其致密結構，可能對多酚類化合物的釋放具有一定阻礙作用。因此直接食用棗皮無法使其中的多酚類化合物充分釋放出來，使其隨著棗皮殘渣排出體外。熱水浸提是中藥傳統口服給藥形式，它利用高溫促進傳質過程，增加溶劑的滲透和多酚類化合物的擴散，但多酚類化合物在水中的溶解度小于在乙醇中，且高溫長時加熱易造成多酚類化合物降解，故將南酸棗皮以藥用方式浸提仍無法實現其充分釋放。而超聲波技術可產生空化效用，通過機械作用破壞棗皮細胞壁，增加乙醇的滲透性，從而使多酚類化合物可與乙醇充分融合而溶出，釋放量最高。

2.2 南酸棗皮中總黃酮的釋放情況

圖2 南酸棗皮總黃酮的釋放量Fig.2 Amount of total flavonoids in Choerospondias axillaris fruit peels

由圖2可知，總黃酮的消化釋放與總多酚的變化相似。模擬胃液消化1 h后，南酸棗皮總黃酮的釋放量為38.55 mg/g，模擬腸液消化2 h后釋放量增加8.78 mg/g，增幅為22.79%，在模擬胃液中的釋放量占模擬胃腸液總釋放量的81.44%。與總多酚的變化趨勢不同的是，在模擬腸液中黃酮類化合物釋放量增幅較大，腸道對其影響較明顯。Bouayed等[13]也發現“Jonaprinz”、“Jonagold”、“Golden”和“Mutzu” 4種蘋果經消化后，腸液中的總黃酮釋放量高于胃液中的釋放量。以上結果可能是由于：1）腸道消化酶有益于黃酮類化合物的釋放，可與南酸棗皮進一步作用釋放黃酮類化合物；2）其他非黃酮類化合物在腸道消化酶及pH值環境的作用下發生結構重組或降解生成黃酮類化合物[13-14,22]。

傳統熱水浸提所得總黃酮的釋放量為80.26 mg/g，是超聲波輔助化學提取所得量的85.22%。模擬胃腸液中總黃酮釋放量分別為傳統熱水浸提和超聲輔助化學提取所得釋放量的58.97%、50.26%。與南酸棗皮中總多酚的釋放量相比，黃酮類化合物在模擬胃腸液中的釋放量較低，與溶劑提取所得釋放量相差較大，溶劑提取更有助于黃酮類化合物的釋放。

2.3 南酸棗皮原花青素的釋放情況

由圖3可知，原花青素在模擬胃、腸液中的釋放與總多酚、總黃酮趨勢不同，呈下降趨勢。經傳統熱水浸提后原花青素釋放量為78.61 mg/g，是超聲波輔助乙醇提取所得釋放量的87.56%。模擬胃液消化后，南酸棗皮原花青素釋放量為37.53 mg/g，占超聲波輔助乙醇提取釋放量的41.81%；經模擬腸液消化后，釋放量顯著下降，降幅為17.87%，與模擬胃液的釋放量之間存在極顯著差異（P＜0.01)。在模擬腸液中，原花青素的降解易受兩種因素影響：1）與胰蛋白酶、膽鹽相互作用發生分解；2）pH值的升高會引起二聚體的分解，當pH值達到8時，所有的二聚體消失，降解為單體或轉化為其他多酚類化合物[23]。由實驗結果可推知，經模擬胃液消化后，從南酸棗皮中釋放的原花青素可能由部分高聚物、大量二聚體和少量單體組成，模擬胃液消化促進其中原花青素的釋放，其含量增加，隨著消化到達腸道，南酸棗皮粉繼續吸水膨脹，空間阻礙減少，在腸道消化酶的作用下仍有部分原花青素釋放，但南酸棗皮中含有較多的二聚體，模擬腸液的pH值在7.0～7.5之間，引起二聚體發生分解，釋放量小于分解量，從而引起原花青素含量降低。綜合比較總多酚、總黃酮和原花青素的釋放情況發現胃、腸道消化可促進多酚類化合物從棗皮中釋放，對釋放到消化液中的多酚類化合物也有較大影響，引起變化趨勢不同，但三者在胃腸道中的釋放量均小于溶劑提取的釋放量。模擬胃腸液消化對原花青素的釋放作用較小，溶劑提取更有利于原花青素的釋放。比較3種處理方式發現，超聲波輔助乙醇提取可充分釋放棗皮中的多酚類化合物，熱水浸提其次，模擬胃腸液消化最低，故南酸棗皮中多酚類化合物的釋放順序為：化學提取＞中藥口服＞直接食用。

圖3 南酸棗皮原花青素的釋放量Fig.3 Amount of proanthocyanidins in Choerospondias axillaris fruit peels

2.4 模擬胃腸液消化各成分的生物利用率

圖4 南酸棗皮的生物利用率Fig.4 Bioavailability of Choerospondias axillaris fruit peels

為了模擬小腸上皮細胞對營養物質的吸收阻礙作用，在體外模擬胃腸液消化實驗中，使用透析袋建立一個簡單的力學模型來完成營養物質的可利用性[24]。由圖4可知，透析袋內總多酚、總黃酮和原花青素釋放量分別為5.94、5.48、3.21 mg/g，生物利用率分別為7.07%、11.59%和10.42%，分別占超聲波輔助乙醇提取總量的4.25%、5.23%和3.58%，生物利用率均較低。腸液pH值偏堿性，消化釋放的高含量多酚類化合物進入腸道后，在弱堿性和低溫條件下，易分解生成小分子，或相互偶聯生成大分子物質，或與其他原料組分之間聚合形成低溶解度或分子質量較大的物質，進而無法穿過透析袋，導致食品的生物利用率較低[25]。比較以上結果可以看出，雖然模擬胃腸液消化無法使黃酮類化合物完全釋放，但是其生物利用率卻高于總多酚，因此透析袋內以黃酮類化合物為主，可推測出人體對黃酮類化合物有較多吸收。

3 結 論

體外模擬胃腸液消化發現，消化過程中消化酶、pH值對南酸棗皮中總多酚、總黃酮、原花青素的釋放有顯著影響。總多酚、總黃酮、原花青素的釋放主要在胃部發生。模擬胃液可促進多酚類化合物的釋放；模擬腸液消化可少量增加總多酚、總黃酮釋放量，其中總黃酮的增幅高于總多酚，但其引起原花青素釋放量的下降。

透析袋具有選擇透過性，根據其孔徑大小，相對分子質量小的物質可穿過透析袋，而大分子物質則被截留在透析袋外。本實驗通過透析袋來模仿小腸上皮細胞對營養物質的吸收阻礙作用，得出黃酮類化合物最可能被人體吸收利用。

綜合比較3種處理方式發現，超聲波輔助乙醇提取可充分釋放棗皮中的多酚類化合物，熱水浸提其次，模擬胃腸液消化僅可釋放部分多酚類化合物，故南酸棗皮中多酚類化合物的釋放量排序為：化學提取＞中藥口服＞直接食用。

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