采用微射流處理改變番茄籽分離蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)

白 雪，張 彬,*，鄧丹雯，趙 強，羅家星，肖義波

（1.南昌大學(xué)中德食品工程中心，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；3.金佳谷物股份有限公司樟樹油廠，江西 樟樹 331200）

目前，我國番茄的種植和加工規(guī)模已位居世界第三，番茄醬出口位居世界第一。番茄加工廠產(chǎn)生的番茄果渣質(zhì)量占原料總質(zhì)量的3%～5%，主要成分是番茄籽，占果渣60%以上[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）統(tǒng)計，2012年中國番茄產(chǎn)量達5 000萬t[2]，可產(chǎn)生90～150萬t番茄籽。

番茄籽中含22.2%～33.9%粗蛋白[1]，且沒有抗營養(yǎng)因子或有害成分[3]，番茄籽蛋白的氨基酸種類齊全，賴氨酸含量較高，達80～100 g/kg，可作為強化賴氨酸的蛋白源[4]。由此可見，番茄籽是一種潛在的廉價蛋白資源。但分離得到的番茄籽蛋白功能性質(zhì)較差，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

高壓微射流利用超高壓、高頻振動、高速撞擊、強烈剪切和氣蝕等一系列機械力綜合作用，可達到很好的微乳化、超微化和均一化效果[5]。微射流均質(zhì)已不同程度地改善了蕓豆分離蛋白[6]、小麥面筋蛋白[7]、乳球蛋白[8]等多種蛋白的功能特性。目前關(guān)于微射流處理番茄籽蛋白、探討功能特性及其結(jié)構(gòu)變化的研究尚未見報道。本實驗采用微射流處理番茄籽蛋白，通過高壓均質(zhì)改變蛋白分子的排列和結(jié)構(gòu)[6,9-10]，提高番茄籽蛋白的功能特性，以期為番茄籽蛋白的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄籽由中糧屯河股份有限公司提供。

三羥甲基胺基甲烷（Tris）、Folin-酚試劑、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 索萊寶化學(xué)試劑公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、5,5’-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甘氨酸 美國Sigma公司；石油醚（沸程60～90℃） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；大豆調(diào)和油市售；其他化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone 12-Plus冷凍干燥機 美國Labconco公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；FSH-Ⅱ型高速勻漿機 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；PB-10 pH計 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Nicolet 5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；Nano-ZS90納米粒度儀 英國馬爾文公司；D8-Focus X衍射儀 德國布魯克公司；M-110EH微射流均質(zhì)機 美國Microfluidics公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄籽分離蛋白（tomato seed protein isolate，TSPI）的制備

番茄籽粉碎后，過60目篩，取過篩的番茄籽粉用于分離番茄籽蛋白。番茄籽粉與石油醚按1∶4（m/V）混合，常溫攪拌1 h，抽濾，浸提液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，番茄籽繼續(xù)用石油醚浸提2次，置通風廚中揮干，得到脫脂番茄籽粉。脫脂番茄籽粉用蒸餾水（1∶20，m/V）分散，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，在50℃保溫30 min，期間滴加NaOH溶液以維持pH值，4 800 r/min離心10 min，收集上清液。用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)該上清液pH值至4.5，4℃冰箱冷沉20 min后，4 800 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀經(jīng)2次水洗后，冷凍干燥，得到的TSPI在－20℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微射流處理

稱取2.5 g TSPI，用250 mL蒸餾水分散，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用普通均質(zhì)機預(yù)處理后，再用微射流均質(zhì)機處理一次，均質(zhì)壓力分別為40、80、120、160 MPa。冷凍干燥，得到的TSPI微射流均質(zhì)樣品在－20℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 溶解性測定

用去離子水配制0.1 g/100 mL的樣品溶液，磁力攪拌30 min，5 000 r/min離心15 min，取適量上清液，以去離子水補足至1 mL，按Folin-酚法測定上清液的蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

乳化活性及乳化穩(wěn)定性采用比濁法測定[11]。乳化活力指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）是指單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的界面面積，可根據(jù)乳狀液的濁度（T）與界面面積（S）的關(guān)系（S=2T），測得吸光度，計算T值[12]。得到T=2.303A（式中：I0為入射光強度；I為透射光強度；A為500 nm波長處的吸光度），再依照該式計算得出EAI值。

EAI和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability i n d e x，E S I）測定方法：在圓底離心管中加入16 mL 0.1 g/100 mL的樣品溶液和4 mL大豆油，用勻漿機以12 000 r/min高速剪切1 min，立即用移液槍從底部0.5 cm處取乳狀液50 μL，加入5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋，渦旋振蕩混勻，在500 nm波長處測吸光度（A0），10 min后再次用移液槍取50 μL乳狀液，用SDS溶液稀釋后測定其吸光度（A10）。

式中：ρ為樣品溶液質(zhì)量濃度/（g/mL），本實驗取0.001 g/mL；φ為油相所占體積分數(shù)/%，取0.20；D為稀釋倍數(shù)，取100；2.303是ln10計算結(jié)果。

1.3.5 表面疏水性測定

表面疏水性的測定采用熒光探針ANS法[13]。用蒸餾水配制0.05 g/100 mL的蛋白質(zhì)溶液，高速分散機（12 000 r/min）均質(zhì)1 min后，再逐步稀釋至質(zhì)量濃度為0.005～0.025 g/100 mL，取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL，測定各質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)的熒光強度（FI0），再分別加入8 mmol/L 的ANS溶液20 μL，渦旋振蕩5 s，避光靜置10 min，然后測定添加ANS溶液的樣品的熒光強度（FI1）。激發(fā)波長λex=390 nm，發(fā)射波長λem=470 nm。FI1與FI0的差值記為FI，以熒光強度FI對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作圖，不同圖的斜率即為不同處理的蛋白分子的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.6 暴露巰基和總巰基含量測定[14]

精確稱取30 mg TSPI樣品，加入10 mL 溶解液（pH 8.0的Tris-Gly緩沖液溶解暴露巰基，Tris-Gly-8 mol/L尿素緩沖液溶解總巰基）中，振蕩溶解，再加入0.1 mL Ellman試劑（DTNB含量為4 mg/mL的Tris-Gly緩沖液），25℃避光振蕩1 h，5 000 r/min離心10 min，測定上清液在412 nm波長處的吸光度（A412nm）。巰基（－SH）含量的計算公式如下。

式中：D為稀釋倍數(shù)，取1.01；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；73.53=106/1.36×104，1.36×104為TNBA（Ellman試劑與巰基反應(yīng)所生成的5-硫代-2-硝基苯甲酸（鹽）陰離子）的摩爾消光系數(shù)，單位為L/（mol·cm）。

1.3.7 X衍射分析

蛋白質(zhì)樣品的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，采用X衍射儀測試。測定條件：Cu Kα輻射，石墨單色器，電壓40 kV，電流40 mA，在2°～60°范圍內(nèi)掃描。

1.3.8 粒徑測定

蛋白質(zhì)樣品用蒸餾水分散，采用粒度儀測定蛋白粒子分布及其大小。

1.3.9 紅外光譜分析

取少量蛋白粉末與KBr混合，充分研磨，壓片，采用傅里葉紅外光譜儀進行掃描。分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，掃描范圍4 000～400 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性體現(xiàn)了蛋白質(zhì)的水化作用，衡量蛋白質(zhì)溶解性的指標是水溶液中蛋白質(zhì)的含量。有研究表明，與高質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液相比，低質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高壓均質(zhì)處理后溶解性更高[15-16]，所以本實驗以1 g/100 mL TSPI為實驗材料。由圖1可知，在160 MPa內(nèi)，TSPI的溶解性隨壓力升高而增大。這主要是因為微射流處理所產(chǎn)生的高頻振動、高速撞擊、強烈剪切等機械作用，使TSPI的分子結(jié)構(gòu)得以伸展，從而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性基團暴露出來，蛋白質(zhì)分子的表面電荷增加，與水的結(jié)合能力增強，從而改善了蛋白的溶解性[17]。

圖1 微射流處理對番茄籽分離蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of microfluidization treatment on the solubility of TSPI

2.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的乳化過程復(fù)雜，影響其乳化性的因素很多，如蛋白分子質(zhì)量分布、溶解性、表面疏水性、pH值等。經(jīng)過微射流處理的TSPI的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的變化如圖2所示。隨著微射流處理壓力的增大，TSPI的EAI和ESI呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，在120 MPa時EAI和ESI達到最大，高于120 MPa，EAI和ESI降低，但均高于未經(jīng)微射流處理樣品。這與溶解性和表面疏水性的結(jié)果比較一致。這可能是因為蛋白質(zhì)的溶解性提高，向油-水界面的擴散能力增強，另一方面，蛋白質(zhì)在壓力的作用下結(jié)構(gòu)變得較為松散，分子去折疊，暴露出更多的極性基團和非極性基團，親水性和親油性提高，從而提高了蛋白質(zhì)的EAI和ESI。壓力進一步加大，可能使已展開的蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用重新聚合，形成了高分子聚集體，表面疏水性減少，蛋白質(zhì)的表面積減小，乳化性能變差[18]。

圖2 微射流處理對番茄籽分離蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of microfluidization treatment on the emulsifying activity and emulsion stability of TSPI

2.3 表面疏水性

疏水相互作用是保持蛋白質(zhì)獨特三維結(jié)構(gòu)的主要作用力，它對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、蛋白質(zhì)構(gòu)象及其功能性質(zhì)，具有顯著的影響。由圖3可知，TSPI的表面疏水性（H0）隨著微射流均質(zhì)處理壓力的增加而增加，壓力上升到120 MPa時，H0達到最大，繼續(xù)增大到160 MPa時，H0反而下降。由此表明，微射流均質(zhì)處理使TSPI的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊，破壞了分子內(nèi)部的疏水相互作用，從而使更多的疏水基團暴露，H0增大；而經(jīng)160 MPa均質(zhì)處理的蛋白質(zhì)H0有所減少，可能是因為壓力過大，使已展開的蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用重新聚合，形成了穩(wěn)定的高分子聚集體[19]。

圖3 微射流處理對番茄籽分離蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of microfluidization treatment on the surface hydrophobicity of TSPI

2.4 總巰基和暴露巰基含量

巰基是蛋白質(zhì)中重要的功能基團，對蛋白的功能性質(zhì)有著重要影響，如成膜性[20]，形成面筋、凝膠等[21]。加熱、還原劑、氧化劑和高壓處理等都能使巰基發(fā)生變化。在蛋白質(zhì)中，一部分游離巰基暴露在表面，一部分埋藏在分子內(nèi)部[22]。由圖4可知，TSPI的暴露巰基與總巰基含量相近，說明TSPI中的巰基大部分是暴露在分子表面的。TSPI的暴露巰基和總巰基含量隨著壓力的升高，均有不同程度的降低。這可能是因為微射流處理時所產(chǎn)生的超高壓、瞬時壓降、強烈剪切等機械作用使分子結(jié)構(gòu)松散，非共價鍵斷裂，內(nèi)部巰基暴露，但暴露出來的巰基容易被氧化生成二硫鍵，從而使其含量降低。也可能是因為高壓處理使得蛋白質(zhì)分子氧化重折疊，在這聚合過程中暴露的巰基被包埋到分子內(nèi)部去了，使暴露巰基減少。這與花生蛋白的研究結(jié)果相似[23]。

圖4 微射流處理對番茄籽分離蛋白巰基含量的影響Fig.4 Effect of microfluidization treatment on the exposed sulfhydryl and total sulfhydryl contents of TSPI

2.5 X衍射分析

X衍射分析主要用來鑒定結(jié)晶化合物，但也可以用于分析含部分結(jié)晶的無定形態(tài)混合物[24]。如大豆分離蛋白，通過研究其衍射角度及其峰型的變化，判斷其晶型結(jié)構(gòu)的變化[25]。

由圖5可知，TSPI的衍射圖譜峰型較寬，說明它是無定型態(tài)混合物。在衍射角2θ=8°和20°附近有兩個主要的衍射峰。與未經(jīng)微射流處理的TSPI相比，經(jīng)過40 MPa以上壓力處理的TSPI的衍射譜圖明顯平坦了許多。由表1可知，衍射峰的強度隨壓力增大而持續(xù)減弱，其中峰2強度減弱幅度較大，40 MPa和80 MPa處理后的TSPI的衍射峰的角度略向左移，當壓力上升到120 MPa和160 MPa，其衍射角卻又向右移動。由此表明，微射流均質(zhì)處理對TSPI的晶型微結(jié)構(gòu)略有破壞，但并不顯著，其晶體結(jié)構(gòu)變化不明顯。

圖5 微射流處理后的番茄籽分離蛋白X衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction curves of TSPI influenced by micro fluidization treatment

表1 微射流處理后的番茄籽分離蛋白X衍射圖譜峰值參數(shù)Table1 Peak parameters of XRD pattern of TSPI influenced by micro fluidization treatment

2.6 粒徑分布

圖6 微射流處理對番茄籽分離蛋白粒度分布的影響Fig.6 Effect of microfluidization treatment on the particle size distribution of TSPI

由圖6可知，經(jīng)過微射流處理的TSPI的粒徑分布向左移動，并且隨著壓力增加，向左移動越大，表明微射流處理使蛋白的粒徑減小了。但經(jīng)160 MPa處理的TSPI的粒子峰向左移動距離略微小于120 MPa處理的TSPI。從表2也可以看出，120 MPa以內(nèi)處理的TSPI的平均粒徑隨壓力的增大而減小，但超過120 MPa，平均粒徑反而有所增大。與未經(jīng)微射流處理的TSPI的粒子峰相比，經(jīng)過處理的TSPI的粒子峰更窄，說明粒徑分布更均勻。微射流作用時所產(chǎn)生的超高壓、瞬時壓降、強烈剪切、高速撞擊等機械作用可破碎蛋白顆粒，形成小顆粒蛋白，使高分子蛋白聚集體解聚，形成較小的分子，所以粒徑更小，這與Bouaouina[26]、Rastogi[27]等的報道相符；但當壓力過大，小分子蛋白又可重新聚合。這就解釋了經(jīng)160 MPa處理的TSPI的粒徑比120 MPa處理得到的TSPI略大。

表2 微射流處理對番茄籽分離蛋白平均粒徑的影響Table2 Effect of micro fluidization treatment on the mean particle diameter of TSPI

2.7 紅外光譜分析

紅外光譜可用于不同質(zhì)量濃度、狀態(tài)及環(huán)境中蛋白質(zhì)或多肽的測定[28]。紅外光譜中酰胺Ⅲ帶不受水分子干擾，不同二級結(jié)構(gòu)在此區(qū)域的光譜性質(zhì)特征明顯，去卷積和擬合后容易將它們分開，避免了酰胺Ⅰ帶中譜峰重疊而導(dǎo)致螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)難以區(qū)分的問題，所以本實驗采用酰胺Ⅲ來進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指認。

圖7 微射流處理后番茄籽分離蛋白的紅外光譜圖Fig.7 Deconvoluted and fitting results of FTIR spectra of TSPI influenced by microfluidization treatment

配合Peakfit 4.12軟件，對TSPI的紅外光譜酰胺Ⅲ帶進行去卷積及擬合，擬合圖見圖7。參照文獻[27]，1 330～1 290 cm-1歸屬為α-螺旋，1 295～1 265 cm-1歸屬為β-轉(zhuǎn)角，1 270～1 245 cm-1歸屬為無規(guī)卷曲，1 250～1 220 cm-1歸屬為β-折疊。表3為TSPI二級結(jié)構(gòu)變化的分析結(jié)果。

由圖7可知，去卷積和擬合后，在酰胺Ⅲ帶區(qū)域獲得了6個子峰。均質(zhì)處理后，1 243 cm-1處的峰發(fā)生了2～4 cm的藍移。從表3中分析得出的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成來看，α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲都有不同程度的減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成增加。與TSPI相比，160 MPa時TSPI的β-折疊增加了22.72%，β-轉(zhuǎn)角減少了11.22%，無規(guī)卷曲減少了8.77%。由此看來，微射流處理使TSPI的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。

表3 番茄籽分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量變化Table3 Changes in the secondary structure contents of TSPI%

3 結(jié) 論

高壓微射流處理可明顯改善TSPI的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性，隨著處理壓力的增加，溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性均不斷提高。當處理壓力為160 MPa時，溶解性達到最大，由原來的9.82%提高到29.96%。乳化活性指數(shù)隨壓力的增加變化不大，而乳化穩(wěn)定性在壓力為120 MPa時，由77.95%提高到93%。處理壓力超過120 MPa時，對蛋白的乳化性能產(chǎn)生不利影響。隨著壓力的增加，蛋白質(zhì)的粒度分布及微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，蛋白質(zhì)顆粒尺寸隨壓力增加而減小，分布也更均勻；經(jīng)120 MPa均質(zhì)后，疏水基團暴露出來，表面疏水性指數(shù)由7 304.6增加到10 980.4；自由巰基基團隨壓力增大而減少，但減少幅度不大；晶體結(jié)構(gòu)變化不顯著。高壓微射流處理后，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了不同程度的變化，α-螺旋、無規(guī)卷曲、β-轉(zhuǎn)角均減少，而β-折疊增加。在不同壓力下TSPI的功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化程度不同的主要原因是蛋白質(zhì)分子的展開/折疊及聚集的程度不同。

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