一株僅產(chǎn)L-乳酸的乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

周 穎，高曉峰，周 晶，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳酸（2-羥基丙酸）是一種天然有機(jī)酸，由于其在食品、化妝品、醫(yī)藥及化工產(chǎn)業(yè)有重要的應(yīng)用而得到廣泛關(guān)注[1]。與消旋的DL-乳酸相比，高光學(xué)純度的乳酸同分異構(gòu)體（L-乳酸和D-乳酸）具有更高的工業(yè)價值[2]。由于人和動物體內(nèi)只有代謝L-乳酸的酶，攝入過量D-乳酸會引起代謝紊亂甚至酸中毒[3]。與此同時，工業(yè)生產(chǎn)的乳酸70%用于食品行業(yè)，主要用于酸奶和奶酪的生產(chǎn)以及食品防腐[4]。綜上所述，光學(xué)純度較高的L-乳酸具有更廣闊的應(yīng)用前景。

全世界絕大部分乳酸的生產(chǎn)是通過發(fā)酵合成的[2]。乳酸生物合成的關(guān)鍵是同型發(fā)酵細(xì)菌，它們通常產(chǎn)生L-乳酸和D-乳酸的混合物[5]。而本實(shí)驗(yàn)研究的乳酸乳球菌KLDS 4.0325屬于同型發(fā)酵，僅分泌L-乳酸且產(chǎn)量較高，因此具有相當(dāng)?shù)墓I(yè)化生產(chǎn)L-乳酸的潛力[6]。

乳酸乳球菌KLDS 4.0325是由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的一株乳酸乳球菌，經(jīng)相關(guān)基因（GenBank登錄號：552063405）分析研究顯示，該菌種中只含有編碼L-乳酸脫氫酶的基因序列，而不含有編碼D-乳酸脫氫酶的基因序列。目前，關(guān)于乳酸乳球菌生產(chǎn)乳酸的研究較少，而關(guān)于只產(chǎn)L-乳酸的乳酸乳球菌的研究更少。本研究希望驗(yàn)證該菌種能夠僅合成L-乳酸而不合成D-乳酸，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基，從而為工業(yè)化生產(chǎn)提供一株可供選擇的僅產(chǎn)L-乳酸的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

乳酸乳球菌KLDS 4.0325由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）提供。

1.1.2 試劑

L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品 美國Sigma公司；L-/D-乳酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；酵母粉 英國Oxoid公司；蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（M17培養(yǎng)基）：大豆蛋白胨5.0 g、蛋白胨2.5 g、酪蛋白胨2.5 g、酵母浸粉2.5 g、牛肉粉5.0 g、乳糖5.0 g、抗壞血酸鈉0.5 g、β-甘油磷酸鈉19.0 g、MgSO40.25 g，充分溶解后用蒸餾水定容至1 L。121℃滅菌15 min（固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加瓊脂15 g）。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、葡萄糖100 g、K2HPO410 g、MgSO40.5 g，充分溶解后定容至1 L，調(diào)節(jié)初始pH 7.0，115℃滅菌20 min；CaCO3于121℃單獨(dú)滅菌15 min，在無菌條件下加入到培養(yǎng)基中，添加量為60 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-87H色譜柱 美國Bio-Rad公司；Waters 2695 Separations Module HPLC System 美國Waters公司；HVE-50電熱蒸汽自動滅菌鍋 日本Hirayama公司；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多有限公司；ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器、SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L-乳酸純度測定

利用L-/D-乳酸檢測試劑盒測定乳酸的光學(xué)純度。L-乳酸的光學(xué)純度按下式計算。

1.3.2 乳酸含量分析方法及乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，除去菌體及多余的CaCO3。取上清液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%的濃硫酸調(diào)節(jié)pH值為2.0左右。取100 μL稀釋10倍，以0.22 μm微孔濾器進(jìn)行過濾即為待測液。

待測液采用Waters高效液相色譜儀分析：色譜柱為HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；檢測器為Waters2414示差檢測器，流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液；流動相流速為0.5 mL/min；柱溫65℃；進(jìn)樣量為20 μL。

取250 mg乳酸標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，定容于25 mL容量瓶中，分別吸取2、4、6、8 mL定容于4個10 mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/mL的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=194 137X－4 177.3（R2=0.999 1）。

1.3.3 菌種移種時間的確定

將菌種活化后以2%的接種量接種于5 mL M17培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)14 h，每隔1 h取樣一次測定OD600nm，用來表示菌體濃度，每組3個平行。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基初始pH值均為7.0，接種量為10%，發(fā)酵溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，發(fā)酵時間為24 h。

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別選擇100 g/L的麥芽糖、半乳糖、木糖、乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇、蔗糖作為唯一碳源進(jìn)行試驗(yàn)，從而確定最佳碳源。

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察20 g/L的不同氮源對L-乳酸產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源。在最佳氮源的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)合氮源優(yōu)化試驗(yàn)，共設(shè)計8個復(fù)配組，分別為1組：2 g/L酵母粉與18 g/L胰蛋白胨；2組：5 g/L酵母粉與15 g/L胰蛋白胨；3組：10 g/L酵母粉與10 g/L胰蛋白胨；4組：15 g/L酵母粉與5 g/L胰蛋白胨；5組：2 g/L酵母粉與18 g/L蛋白胨；6組：5 g/L酵母粉與15 g/L蛋白胨；7組：10 g/L酵母粉與10 g/L蛋白胨；8組：15 g/L酵母粉與5 g/L蛋白胨?？疾觳煌磸?fù)配對L-乳酸產(chǎn)量的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，蔗糖和酵母粉以及蛋白胨被選出用于Plackett-Burman設(shè)計試驗(yàn)，在參考了相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]后，又選取了MgSO4質(zhì)量濃度、K2HPO4質(zhì)量濃度、NaCl質(zhì)量濃度、CH3COONa質(zhì)量濃度一同作為考察對象。通過Design Expert軟件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計（表1），以L-乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過比較各因素的顯著性水平，篩選出對L-乳酸產(chǎn)量影響較顯著的因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平設(shè)計Table1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)及分析結(jié)果設(shè)計爬坡試驗(yàn)，即對顯著因素進(jìn)行質(zhì)量濃度的梯度設(shè)計。在培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，可以根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)擬合出的方程來確定各變量的最速上升路徑和變化步長，若系數(shù)為正，則該因素水平為遞增，反之遞減；以系數(shù)最大的變量為基準(zhǔn)確定基本步長，以其他變量與基準(zhǔn)變量系數(shù)的比值來確定其他變量的步長，確定了上升或下降方向及變化步長后便可以選取中心點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計[9]。

1.3.7 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基組分

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果選取3個主要因素進(jìn)行響應(yīng)面分析法中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)因素及水平見表2。并用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。通過數(shù)據(jù)擬合相應(yīng)模型，得到二次多項式，并最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

表2 中心組合試驗(yàn)因素及水平設(shè)計Table2 Factors and levels used in central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸光學(xué)純度測定結(jié)果

通過試劑盒檢測，乳酸乳球菌KLDS 4.0325可產(chǎn)生光學(xué)純度100%的L-乳酸，這也是該菌株優(yōu)于其他乳酸生產(chǎn)菌株的原因之一。Lactobacillus paracasei LA104生產(chǎn)L-乳酸的光學(xué)純度為97.3%[10]，Bacillus subtilis MUR1生產(chǎn)L-乳酸的光學(xué)純度為99.5%[11]。

2.2 菌種的移種時間

在乳酸發(fā)酵過程中選擇合適的移種時間至關(guān)重要，過老或年輕的種子都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響[12]。一般來講，菌體處于對數(shù)生長中后期為移種的最佳時期。此時的種子繁殖能力強(qiáng)且菌體濃度高，接入發(fā)酵培養(yǎng)基后能很快進(jìn)入對數(shù)生長期，有利于發(fā)酵的進(jìn)行。由圖1可知，菌種的對數(shù)生長期為2～5 h，因此確定移種時間為5 h。

圖1 乳酸乳球菌KLDS 4.0325的生長曲線Fig.1 Cell growth curve of KLDS 4.0325

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同碳源對L-乳酸產(chǎn)量的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，碳源分別替換成不同的糖類，其他條件不變，比較不同碳源對L-乳酸產(chǎn)量的影響。由圖2可知，蔗糖作為碳源時L-乳酸產(chǎn)量最大為25.2 g/L，這也說明乳酸乳球菌KLDS 4.0325具有利用工業(yè)廢料糖蜜的潛質(zhì)。而以乳糖和木糖作為碳源時，L-乳酸產(chǎn)量極少。

圖2 不同碳源對L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on L-lactic acid content

2.3.2 不同氮源對L-乳酸產(chǎn)量的影響

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，氮源分別替換成酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、乳清，其他條件不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。由圖3可知，酵母粉作為氮源時L-乳酸的產(chǎn)量明顯高于其他氮源，這可能與酵母粉中富含豐富的氨基酸、維生素等生長因子有關(guān)，這一結(jié)果與Kadam[13]、王玉華[14]、秦浩[15]、吳再強(qiáng)[16]等的研究結(jié)果一致。

圖3 不同氮源對L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on L-lactic acid content

2.3.3 復(fù)合氮源優(yōu)化結(jié)果

圖4 不同氮源組合對L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of mixed nitrogen sources on L-lactic acid content

雖然使用酵母粉單獨(dú)做氮源時L-乳酸產(chǎn)量最高，但是相對其他氮源來說，酵母粉價格昂貴，這將嚴(yán)重阻礙乳酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[17]。為了減少成本，將酵母粉與兩種價格相對低廉的氮源混合發(fā)酵，保持總氮含量為20 g/L，由圖4可知，第5組，即2 g/L酵母粉與18 g/L蛋白胨的復(fù)配效果最好。這可能是由于酵母粉為菌株提供生長因子等微量營養(yǎng)物質(zhì)，因此較少的酵母粉即可達(dá)到此目的。與其他乳酸菌[18-20]相比，乳酸乳球菌KLDS 4.0325對酵母粉的需求量相對較少。

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)，分析7個因素對L-乳酸產(chǎn)量的影響。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表3。當(dāng)P=Prob＞F小于0.05時，該因素對L-乳酸產(chǎn)量有顯著影響，并且F值越大則表示該因素對L-乳酸產(chǎn)量影響越大。由表4可知，因素A、B、E對L-乳酸產(chǎn)量有顯著影響，且可信度在95%置信區(qū)間內(nèi)，其中因素A（蔗糖添加量）對L-乳酸產(chǎn)量影響最大，其次為因素E（K2HPO4添加量）、因素B（酵母粉添加量），而其他因素對L-乳酸產(chǎn)量沒有顯著影響。選擇以上3個有顯著影響的因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。注：*.P＜0.05，表示差異顯著。表7同。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of Plackett-Burman experimental design

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table4 Regression analysis of Plackett-Burman results

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

表5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of steepest ascent design

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，選擇合適的步長進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，為中心組合試驗(yàn)提供合適的中心試驗(yàn)點(diǎn)。由表5可知，第4組對應(yīng)的L-乳酸產(chǎn)量最大。因此，選擇第4組作為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析

以L-乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值（設(shè)為Y），采用因素n=3，試驗(yàn)次數(shù)N=20的中心組合設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。各因素、水平及試驗(yàn)結(jié)果見表6。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Table6 Response surface central composite design layout and experimental results

表7 回歸模型方差分析Table7 Analysis of variance (ANOVA) for regression equation

通過Design Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表7可知，本實(shí)驗(yàn)所選模型P=0.000 1＜0.05，說明方程擬合度較好；失擬項P=0.212 6＞0.05，說明失擬項不顯著；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.962 2，表明預(yù)測值和實(shí)測值相關(guān)性高；調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj=0.928 1，R2Pre=0.784 3，二者之間相差較小，表明模型可信度高，能很好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由表7可知，模型一次項A、E處于顯著水平，B項不顯著；交互項BE、AB、AE項均不顯著。

2.7 模型驗(yàn)證及分析

對二次方程求導(dǎo)，當(dāng)蔗糖、酵母粉、K2HPO4的添加量分別為102.9、2.5、7.9 g/L時，對應(yīng)的L-乳酸產(chǎn)量最高為86.3 g/L。為了驗(yàn)證方程的準(zhǔn)確性，在上述條件下經(jīng)行3次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測得L-乳酸產(chǎn)量分別為86.6、87.2、85.9 g/L，平均值為86.6 g/L，與方程預(yù)測值86.3 g/L的相對誤差為0.3%，說明該方程具有參考價值，能夠?yàn)樯a(chǎn)提供一定的實(shí)踐依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的L-乳酸產(chǎn)量是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3.4倍，產(chǎn)酸速率可達(dá)3.61 g/（L?h）。相對于乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸，乳酸乳球菌KLDS 4.0325具有僅產(chǎn)L-乳酸的特性，且產(chǎn)酸速率高于乳桿菌[13]。

目前為止，國內(nèi)關(guān)于乳酸乳球菌生產(chǎn)乳酸的報道較少，國外有Lactococcus lactis IO-1[21]、L.lactis ATCC 19435[5]，L.lactis ssp.cremoris ASCC 930119[22]，L.lactis IFO 12007[23]等菌種生產(chǎn)L-乳酸的研究報道。Ramchandran等[22]研究了利用L.lactis ssp.cremoris ASCC 930119通過浸沒式發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，產(chǎn)量可達(dá)60 g/L。L.lactis IO-1[24]搖瓶發(fā)酵乳酸產(chǎn)量為13.81 g/L，產(chǎn)酸速率為1.73 g/（L?h），與乳酸乳球菌KLDS 4.0325產(chǎn)酸量86.6 g/L、產(chǎn)酸速率3.61 g/（L?h）有較大的差距。Shi Zhouming等[5]研究了以菊芋粉為碳源，固定L.lactis ATCC 19435在纖維素膜反應(yīng)器上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，產(chǎn)酸量可達(dá)142 g/L，產(chǎn)酸速率約為2.06 g/（L?h），該研究采用了先進(jìn)的發(fā)酵技術(shù)，乳酸產(chǎn)量高于本實(shí)驗(yàn)的菌株，而產(chǎn)酸速率卻低于乳酸乳球菌KLDS 4.0325。Ramchandran等[22]研究了L.lactis ssp.cremoris ASCC930119利用乳清粉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，最大產(chǎn)酸量可達(dá)60 g/L，明顯低于本實(shí)驗(yàn)菌株。

3 結(jié) 論

本研究采用一株L-乳酸光學(xué)純度達(dá)100%的乳酸乳球菌KLDS 4.0325生產(chǎn)L-乳酸，并優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到的回歸方程具有較高的擬合度，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。優(yōu)化后培養(yǎng)基成分為：蔗糖質(zhì)量濃度102.9 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度2.5 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度7.9 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度18 g/L、MgSO4質(zhì)量濃度2.5 g/L、NaCl質(zhì)量濃度0.2 g/L、CH3COONa質(zhì)量濃度1 g/L。優(yōu)化后L-乳酸產(chǎn)量是優(yōu)化前的3.4倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株營養(yǎng)需求簡單，產(chǎn)酸量可觀，發(fā)酵周期短。以蔗糖為最佳碳源說明其具有利用工業(yè)廢料糖蜜的潛力，從而降低L-乳酸生產(chǎn)成本。酵母粉對其生產(chǎn)L-乳酸起到至關(guān)重要的作用，但極少量的酵母粉即可滿足其需要。因此該菌種具有相當(dāng)?shù)墓I(yè)生產(chǎn)L-乳酸的潛力。

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