響應(yīng)面法優(yōu)化食用菌農(nóng)平1號(hào)固態(tài)發(fā)酵豆渣的條件

王夫杰，趙金楊，張金蘭，郭鴻源，孫 勇,，王文平，張 建，趙 燕,,*

（1.北京市食品釀造研究所，北京 100050；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.北京市食品研究所，北京 100162）

豆渣是豆腐、腐竹、豆?jié){、腐乳等大豆制品加工中的主要副產(chǎn)物，約占全豆干質(zhì)量的15%～20%。豆渣干物質(zhì)中，膳食纖維含量高于50%，蛋白質(zhì)含量在20%左右[1]。膳食纖維具有預(yù)防心血管疾病[2-3]、肥胖癥[4]、糖尿病[5]、腸癌[6-7]、高血脂癥[8]等生理效應(yīng)，其在食品中的價(jià)值已被廣泛認(rèn)可[9-12]。豆渣蛋白質(zhì)的氨基酸組成與聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織與世界衛(wèi)生組織提出的參考值相接近，為優(yōu)質(zhì)植物蛋白[13]。此外，豆渣還含有大豆異黃酮、鈣、磷、鐵、鋅、鉀、鎂等多種微量元素。因此，豆渣具有優(yōu)質(zhì)食品資源的潛質(zhì)。

濕豆渣營(yíng)養(yǎng)豐富、難貯運(yùn)、纖維顆粒大、豆腥味重、存在抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此很難直接用于食品生產(chǎn)，主要用作飼料。但如果直接用作飼料，由于抗?fàn)I養(yǎng)因子和適口性差，使用量也很有限，處理不及時(shí)的豆渣很容易腐敗變質(zhì)，對(duì)環(huán)境造成污染。隨著國(guó)家對(duì)資源利用和環(huán)境保護(hù)的重視，豆渣資源在食品加工中的應(yīng)用研究也取得很多進(jìn)展，主要包括在焙烤食品[14-16]、膨化食品[17-18]、調(diào)味品[19-21]等領(lǐng)域的應(yīng)用，因?yàn)槎乖w維顆粒大，對(duì)食品加工性能有不良影響，添加量非常有限。超高壓[22-23]、擠壓膨化[24-25]、微生物發(fā)酵[26-27]是改變豆渣纖維結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)。其中，微生物發(fā)酵對(duì)設(shè)備要求低、技術(shù)易掌握、操作簡(jiǎn)便、成本低，對(duì)纖維實(shí)現(xiàn)有效降解的同時(shí)能消除豆渣中抗?fàn)I養(yǎng)因子，并產(chǎn)生新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是改善豆渣加工性能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的安全有效的方式。

本實(shí)驗(yàn)將霉菌、酵母菌、細(xì)菌以及目前在豆渣應(yīng)用中研究較少的食用菌類用于豆渣固態(tài)發(fā)酵，篩選出適宜豆渣發(fā)酵的菌種，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化豆渣發(fā)酵的工藝參數(shù)，旨在為豆渣資源的綜合利用和發(fā)酵豆渣產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

豆渣：由北京太平街菜市場(chǎng)豆腐坊提供，豆渣成分見表1。

表1 豆渣原料成分的組成Table1 Chemical composition of okara

菌種：白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)、農(nóng)大杏鮑菇、香菇、木耳、茶樹菇 北京吉蕈園科技有限公司；少孢根霉、雅致放射毛霉AS3.2778、米根霉3.010、米根霉AS3.866、紅曲霉AS3.972、魯氏酵母、球擬酵母、釀酒酵母AS2.1392、醬油生香酵母1.039、米曲霉滬釀3.042、AS3.758、納豆菌1.0023、乳酸菌1.08北京市食品釀造研究所菌種站；魯氏毛霉AS3.2545、中華根霉AS3.947、華根霉IFFI3091、華根霉AS3.4195、五通橋毛霉AS3.25、普雷恩毛霉GIM3.466、康寧木霉CICC13012、綠色木霉CICC13015、里氏木霉CICC40358、粗糙脈孢菌AS3.1603 廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

SHH-50霉菌培養(yǎng)箱 重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠；Kjeltec2300凱氏定氮儀（配2006消化爐） 丹麥福斯集團(tuán)；PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；101-3A數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海瀘南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠；CJ-1B潔凈工作臺(tái) 北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；YX-280手提式壓力蒸汽消毒器 天津市泰斯特儀器有限公司；BP210S電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；H.H.S11-2電熱恒溫水浴鍋上海醫(yī)療器械五廠。

1.3 方法

1.3.1 豆渣固態(tài)發(fā)酵工藝流程

1.3.2 豆渣發(fā)酵菌種的篩選

從霉菌、酵母菌、細(xì)菌、食用菌中篩選適合豆渣固態(tài)發(fā)酵的菌種，以微生物在豆渣中的生長(zhǎng)情況及發(fā)酵后豆渣的感官作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行初篩。在初篩的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)含量和氨基酸態(tài)氮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行復(fù)篩，篩選出適宜豆渣固態(tài)發(fā)酵的菌種。

豆渣發(fā)酵以市售濕豆渣為基質(zhì)，水分含量在82%左右，豆渣裝瓶量為70 g/250 mL，pH值自然。

白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)、農(nóng)大杏鮑菇、香菇、木耳、茶樹菇、康寧木霉CICC13012、綠色木霉CICC13015、里氏木霉CICC40358、粗糙脈孢菌AS3.1603、紅曲霉AS3.972：菌種活化后挑取菌絲2 環(huán)接種到豆渣基質(zhì)，在28℃培養(yǎng)7 d；魯氏毛霉AS3.2545、中華根霉AS3.947、華根霉IFFI3091、華根霉AS3.4195、五通橋毛霉AS3.25、普雷恩毛霉GIM3.466：菌種活化后挑取菌絲2 環(huán)接種到豆渣基質(zhì)，在28℃培養(yǎng)3 d；少孢根霉、雅致放射毛霉AS3.2778、米根霉3.010、米根霉AS3.866、米曲霉滬釀3.042、AS3.758：菌種活化后挑取菌絲或孢子2 環(huán)接種到豆渣基質(zhì)，在30℃培養(yǎng)3 d；魯氏酵母、球擬酵母、釀酒酵母AS2.1392、醬油生香酵母1.039：接種體積分?jǐn)?shù)10%的液體菌種，在30℃培養(yǎng)3 d；納豆菌1.0023、乳酸菌1.08：接種10%的液體菌種，在37℃培養(yǎng)3 d。

1.3.3 豆渣固態(tài)發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 豆渣初始pH值的確定

分別選取豆渣初始pH值為4、5、6、7、8，初始含水量為75%，豆渣裝瓶量為70 g/250 mL，農(nóng)平1號(hào)接種量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 d，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.2 豆渣初始含水量的確定

分別選取豆渣初始含水量為65%、70%、75%、80%、85%，初始pH值為1.3.3.1節(jié)中最優(yōu)pH值，豆渣裝瓶量為70 g/250 mL，農(nóng)平1號(hào)接種量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 d，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.3 裝瓶量的確定

發(fā)酵用250 mL三角瓶，分別選取裝瓶量為50、60、70、80、90 g，初始pH值為1.3.3.1節(jié)中最優(yōu)pH值，初始含水量為1.3.3.2節(jié)中最優(yōu)含水量，農(nóng)平1號(hào)接種量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 d，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.4 接種量的確定

分別選取農(nóng)平1號(hào)接種量6%、8%、10%、12%、14%，初始pH值為1.3.3.1節(jié)中最優(yōu)pH值，初始含水量為1.3.3.2節(jié)中最優(yōu)含水量，豆渣裝瓶量為1.3.3.3節(jié)中最優(yōu)裝瓶量，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為10 d，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.5 培養(yǎng)時(shí)間的確定

分別選取培養(yǎng)時(shí)間為6、8、10、12、14 d，初始pH值為1.3.3.1節(jié)中最優(yōu)pH值，初始含水量為1.3.3.2節(jié)中最優(yōu)含水量，豆渣裝瓶量為1.3.3.3節(jié)中最優(yōu)裝瓶量，農(nóng)平1號(hào)接種量為1.3.3.4節(jié)中最優(yōu)接種量，培養(yǎng)溫度為28℃，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.6 培養(yǎng)溫度的確定

分別選取培養(yǎng)溫度24、26、28、30、32℃，初始pH值為1.3.3.1節(jié)中最優(yōu)pH值，初始含水量為1.3.3.2節(jié)中最優(yōu)含水量，豆渣裝瓶量為1.3.3.3節(jié)中最優(yōu)裝瓶量，農(nóng)平1號(hào)接種量為1.3.3.4節(jié)中最優(yōu)接種量，培養(yǎng)時(shí)間為1.3.3.5節(jié)中最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 豆渣固態(tài)發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以豆渣初始pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素為自變量，以發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮含量和蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了優(yōu)化發(fā)酵條件的四因素三水平試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立皆采用Design Expert（Version 8.0.6）來(lái)進(jìn)行。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：依照GB/T 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法測(cè)定。結(jié)果以干基計(jì)。

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》規(guī)定的方法檢測(cè)。結(jié)果以干基計(jì)。

水分含量測(cè)定：依照GB/T 5009.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》，采用直接干燥法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣發(fā)酵用菌種的篩選結(jié)果

表2 豆渣發(fā)酵用菌種初篩結(jié)果Table2 Preliminary screening results of strains for okara fermentation

選取7種食用菌菌種、15種霉菌、4種酵母菌、乳酸菌1.08、納豆菌1.0023及粗糙脈孢菌AS3.1603，通過(guò)觀察各菌種在豆渣上的生長(zhǎng)情況及發(fā)酵豆渣感官質(zhì)量，對(duì)豆渣發(fā)酵用菌種進(jìn)行初篩。將發(fā)酵豆渣高壓滅菌后評(píng)價(jià)豆渣咀嚼吞咽時(shí)的渣感變化，結(jié)果見表2。有菌絲生長(zhǎng)的微生物更適宜于豆渣固態(tài)發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)中酵母菌、乳酸菌及納豆菌在豆渣固態(tài)基質(zhì)上單獨(dú)培養(yǎng)很難生長(zhǎng)。食用菌類微生物生長(zhǎng)相對(duì)較慢，在豆渣上培養(yǎng)到長(zhǎng)滿菌絲需要7～10 d，發(fā)酵豆渣顏色好，帶有菌菇特有的清香，有些食用菌在豆渣上生長(zhǎng)困難。大部分霉菌類微生物能很好的在豆渣固態(tài)基質(zhì)中生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)速率快、菌絲密度大，很少出現(xiàn)染菌。霉菌發(fā)酵的豆渣富有彈性，往往帶有發(fā)酵特有的霉味，顏色多數(shù)為黃褐色，霉菌的孢子會(huì)對(duì)豆渣顏色產(chǎn)生一定影響。其中，米曲霉3.042和黑曲霉3.758的孢子帶有苦味，其發(fā)酵豆渣也呈苦味，但多數(shù)不會(huì)影響豆渣的味道。目前采用的發(fā)酵工藝沒有后發(fā)酵和滅活工序，很難消除孢子帶來(lái)的苦味，產(chǎn)苦味孢子的菌種不考慮用于目前的實(shí)驗(yàn)。

圖1 各菌種發(fā)酵豆渣的氨基酸態(tài)氮含量Fig.1 Contents of amino acid nitrogen in fermented okara with different strains

圖2 各菌種發(fā)酵豆渣的蛋白質(zhì)含量Fig.2 Contents of crude protein in fermented okara with different strains

根據(jù)所選用微生物在豆渣中的生長(zhǎng)情況及發(fā)酵豆渣的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，篩選出3.010、AS3.2778、少孢根霉、AS3.2545、AS3.947、IFFI3091、AS3.4195、AS3.25、GIM3.466、CICC13012、CICC13015、CICC40358、AS3.1603、白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)、農(nóng)大杏鮑菇，進(jìn)行豆渣發(fā)酵用菌種的復(fù)篩。以豆渣原料及傳統(tǒng)豆渣發(fā)酵食品霉豆渣（信陽(yáng)霉豆渣、安慶霉豆渣、孝感霉豆渣）為對(duì)照，以氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行豆渣發(fā)酵用菌種的復(fù)篩，確定豆渣發(fā)酵用菌種，氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量均以干基計(jì)算，結(jié)果見圖1、2。發(fā)酵豆渣樣品較豆渣原料，氨基酸態(tài)氮含量和蛋白質(zhì)含量均有不同程度增加，多個(gè)樣品的指標(biāo)含量?jī)?yōu)于購(gòu)買到的霉豆渣樣品。豆渣發(fā)酵過(guò)程中，微生物產(chǎn)生的蛋白酶將豆渣中的蛋白質(zhì)降解，使得發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮含量明顯增加。隨著豆渣中蛋白質(zhì)的降解，蛋白質(zhì)含量在理論上應(yīng)該表現(xiàn)為下降，實(shí)際測(cè)定結(jié)果顯示發(fā)酵后豆渣蛋白質(zhì)含量均高于未發(fā)酵豆渣，這可能主要由兩方面因素引起：一是微生物生長(zhǎng)消耗氮源的同時(shí)消耗碳源，從而引起蛋白質(zhì)含量的相對(duì)升高；另一方面是微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的菌絲蛋白，造成蛋白質(zhì)含量的絕對(duì)升高。

3.010、CICC13012、CICC13015、AS3.1603、白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)發(fā)酵豆渣的蛋白質(zhì)含量高于24%，安慶霉豆渣、3.010、少孢根霉、CICC13015、白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)發(fā)酵豆渣的氨基酸態(tài)氮含量高于1.50%，白雪金針、特白平菇、農(nóng)平1號(hào)、3.010、CICC13015發(fā)酵豆渣的蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量都比較高。

目前關(guān)于豆渣固態(tài)發(fā)酵用微生物研究較多的是霉菌[28-29]，發(fā)酵后豆渣樣品氨基酸態(tài)氮含量的較高值在1.7%左右，蛋白質(zhì)含量在25%左右。實(shí)驗(yàn)中霉菌發(fā)酵豆渣樣品的氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量與文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道相一致，其中，3.010和少孢根霉對(duì)豆渣發(fā)酵效果更好。食用菌發(fā)酵豆渣樣品氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量最高，其中，白雪金針和農(nóng)平1號(hào)的氨基酸態(tài)氮含量超過(guò)2%，蛋白質(zhì)含量達(dá)到30%，在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中很少見。本實(shí)驗(yàn)選取農(nóng)平1號(hào)用于豆渣固態(tài)發(fā)酵。

2.2 豆渣固態(tài)發(fā)酵的單因素結(jié)果

以發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了豆渣初始含水量、初始pH值、裝瓶量、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆渣發(fā)酵的影響，氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量均以干基計(jì)算。

2.2.1 初始pH值對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

豆渣在不同初始pH值條件下發(fā)酵后的氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量見圖3，初始pH值越低，發(fā)酵豆渣的氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量越低，豆渣發(fā)酵適宜pH值為6～8。

圖3 初始pH值對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of initial pH on okara fermentation

2.2.2 初始含水量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

豆渣膳食纖維含量高，持水性好，在水分含量85%時(shí)也很少有自由水析出。由圖4可知，豆渣初始含水量在75%～85%時(shí)，發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量較高。豆制品加工所得濕豆渣水分含量通常在82%左右，因此直接選擇濕豆渣用于發(fā)酵。

圖4 初始含水量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial moisture content on okara fermentation

2.2.3 裝瓶量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

圖5 裝瓶量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of okara amount in shake flasks on fermentation

由圖5可知，裝瓶量對(duì)發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量的影響并不大，250 mL三角瓶裝60 g豆渣時(shí)，氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量最高，因此試驗(yàn)選擇裝瓶量為60 g/250 mL。

2.2.4 接種量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

種子濃度過(guò)低，往往會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，而種子濃度過(guò)高則會(huì)引起菌體過(guò)早進(jìn)入衰亡期，導(dǎo)致發(fā)酵能力下降。試驗(yàn)在接種量6%～14%范圍內(nèi)考察接種量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響，其結(jié)果如圖6所示。接種量在8%～12%時(shí)，發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量更高。

圖6 接種量對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on okara fermentation

2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of incubation time on okara fermentation

農(nóng)平1號(hào)生長(zhǎng)比較緩慢，相對(duì)霉菌類微生物，其發(fā)酵周期更長(zhǎng)。由圖7可知，培養(yǎng)時(shí)間低于8 d時(shí)，豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量較低，農(nóng)平1號(hào)的適宜培養(yǎng)時(shí)間為10～14 d。

2.2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)豆渣發(fā)酵的影響

溫度是發(fā)酵過(guò)程中影響微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一，適宜的溫度是菌體生長(zhǎng)所必需的，它直接影響菌體數(shù)量，并影響發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行，另外溫度的高低可相應(yīng)延長(zhǎng)或縮短發(fā)酵周期。不同溫度下，農(nóng)平1號(hào)發(fā)酵豆渣的氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量見圖8。隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)升高，在30℃時(shí)氨基酸態(tài)氮含量最高，28～32℃條件下氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量較高。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)豆渣發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of incubation temperature on okara fermentation

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化豆渣發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以豆渣初始pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素為自變量，以發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮含量和蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了優(yōu)化發(fā)酵條件的四因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Experimental design and results of response surface methodology

2.3.1 模型的建立與顯著性分析

利用Design Expert（Version 8.0.6）軟件對(duì)表3中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，可獲得豆渣初始pH值（A）、接種量（B）、培養(yǎng)溫度（C）、培養(yǎng)時(shí)間（D）和氨基酸態(tài)氮含量（Y1）、蛋白質(zhì)含量（Y2）之間的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y1=3.27+0.39A+0.24B+0.21C+0.33D－0.088AB－0.080AC+5.000×10－3AD－0.080BC－0.015BD+0.045CD－0.55A2－0.43B2－0.50C2－0.52D2

Y2=33.19+2.31A+1.68B+1.39C+2.22D－0.66AB－0.47AC－0.61AD+0.085BC－0.32BD+0.11CD－3.22A2－2.67B2－2.93C2－3.49D2

對(duì)統(tǒng)計(jì)測(cè)試模型進(jìn)行方差分析，氨基酸態(tài)氮含量的二次多項(xiàng)式擬合模型的方差分析和回歸方程系數(shù)見表4。可知，回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著（P=0.139 3），說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，擬合檢驗(yàn)極顯著（P＜0.000 1），方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響是極顯著的，交互項(xiàng)不顯著，該模型的決定系數(shù)R2=0.982 9，調(diào)整后的判定系數(shù)R2Adj=0.965 8，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)值擬合很好，較好地反映了氨基酸態(tài)氮含量與豆渣初始pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)豆渣發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

表4 氨基酸態(tài)氮含量回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table4 Significance test and analysis of variance for the regression model

表5 蛋白質(zhì)含量回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table5 Significance test and analysis of variance for the regression model

對(duì)統(tǒng)計(jì)測(cè)試模型進(jìn)行方差分析，蛋白質(zhì)含量的二次多項(xiàng)式擬合模型的方差分析和回歸方程系數(shù)見表5。可知，回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著（P=0.693 5），說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，擬合檢驗(yàn)極顯著（P＜0.000 1），方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響是極顯著的，交互項(xiàng)不顯著，該模型的決定系數(shù)R2=0.979 9，調(diào)整后的判定系數(shù)R2Adj=0.959 7，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)值擬合很好，較好地反映了蛋白質(zhì)含量與豆渣初始pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)豆渣發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

2.3.2 響應(yīng)面分析

為了考察交互項(xiàng)對(duì)豆渣發(fā)酵的影響，在其他因素條件固定不變的情況下，對(duì)模型進(jìn)行降維分析。經(jīng)Design-Expert V8.0.6軟件分析所得的響應(yīng)面圖見圖9、10。隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大；響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。

圖9 各因素交互作用對(duì)發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plots showing the interactive effects of four process parameters on the amino acid nitrogen contents of okara

圖10 各因素交互作用對(duì)發(fā)酵豆渣蛋白質(zhì)含量影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface plotsshowing the interactive effects of four process parameters on the crude protein content of fermented okara

2.3.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)Design Expert V8.0.6軟件分析優(yōu)化，得到豆渣發(fā)酵產(chǎn)氨基酸態(tài)氮的最佳條件為豆渣初始pH 7.33、接種量10.45%、培養(yǎng)溫度30.37℃、培養(yǎng)時(shí)間12.65 d，在此條件下，氨基酸態(tài)氮的理論值為3.44%；豆渣發(fā)酵產(chǎn)蛋白質(zhì)的最佳條件為豆渣初始pH 7.29、接種量10.53%、培養(yǎng)溫度30.45℃、培養(yǎng)時(shí)間12.57 d，在此條件下，蛋白質(zhì)含量的理論值為34.22%；綜合考慮發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量，豆渣固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為豆渣初始pH 7.31、接種量10.48%、培養(yǎng)溫度30.4℃、培養(yǎng)時(shí)間12.6 d，在此條件下，氨基酸態(tài)氮含量的理論值為3.44%，蛋白質(zhì)含量的理論值為34.21%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性，采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行豆渣固態(tài)發(fā)酵的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，考慮到試驗(yàn)的可操作性，將試驗(yàn)條件設(shè)為：豆渣初始pH 7.5、接種量10.5%、培養(yǎng)溫度30.5℃、培養(yǎng)時(shí)間13 d。采用上述優(yōu)化條件發(fā)酵，每100 g干豆渣的氨基酸態(tài)氮含量為3.34 g，與理論值相差2.98%（n=4），蛋白質(zhì)含量為33.86 g，與理論值相差1.02%（n=4），這說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化的條件是可行的，有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。目前，食用菌在豆渣利用方面的研究較少，主要是以豆渣作為氮源進(jìn)行食用菌液態(tài)培養(yǎng)[30-33]，尚未見將食用菌用于豆渣固態(tài)發(fā)酵的報(bào)道。

3 結(jié) 論

豆渣發(fā)酵用菌種篩選結(jié)果顯示：有氣生菌絲的菌種更容易在豆渣固態(tài)基質(zhì)中生長(zhǎng)，能有效消除豆渣渣感，實(shí)驗(yàn)用的酵母菌、乳酸菌很難單獨(dú)在豆渣固態(tài)基質(zhì)中生長(zhǎng)；相對(duì)食用菌，霉菌生長(zhǎng)時(shí)間更短，發(fā)酵豆渣彈性好；相對(duì)霉菌，食用菌不產(chǎn)孢子，發(fā)酵豆渣顏色更好，有菌菇特有的香氣；根據(jù)發(fā)酵豆渣氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量，選擇農(nóng)平1號(hào)用于豆渣固態(tài)發(fā)酵。

單因素結(jié)果表明豆渣初始pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間是影響豆渣發(fā)酵的重要因素；根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果和實(shí)際操作的可行性，選擇豆渣固態(tài)發(fā)酵的最佳條件為：豆渣初始pH 7.5、接種量10.5%、培養(yǎng)溫度30.5℃、培養(yǎng)時(shí)間13 d，在此條件下，每100 g干豆渣的氨基酸態(tài)氮含量為3.34 g，與理論值相差2.98%，蛋白質(zhì)含量為33.86 g，與理論值相差1.02%，實(shí)測(cè)值與理論值之間具有良好的擬合度，試驗(yàn)所得模型對(duì)于優(yōu)化豆渣固態(tài)發(fā)酵工藝是合理的。

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