植物乳桿菌表面性質及對Caco-2細胞的黏附

李 清，劉小莉，王 英，董明盛，周劍忠,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

益生菌是指能以一定數量存活并定殖于宿主腸道內，通過調節腸道菌群平衡對宿主健康發揮有益作用的單一或者特定微生物混合物[1-3]。為了調節人體腸道，發揮益生作用，益生菌必須能夠在胃腸道中良好定殖，而對黏膜的黏附是定殖及增生的第一步[4-6]。益生菌的黏附能力可為其提供競爭優勢，是其在人體消化道中長期定殖的必要條件。益生菌黏附過程包括菌體與不同接觸表面之間的非特異性物理作用和黏附素與特定受體間的特異性結合[7]。特異性黏附是通過特定的黏附素-受體結合實現的；非特異性黏附則是通過疏水相互作用、靜電作用等進行。闡明益生菌的黏附機理對于制備益生菌制劑和更好地認識微生態學基本規律都具有十分重要的意義。

體外研究益生乳桿菌黏附最常用的方法是體外細胞培養法。人體結腸腺癌細胞系如Caco-2細胞株，因其在體外生長所表現出的形態和功能特征可以模擬成熟腸道上皮細胞[8-9]，常作為體外模型來評價乳桿菌的黏附和定殖能力，但是體外培養細胞一般耗時較長，耗費較高，因此研究乳桿菌的自聚集能力和疏水性也可以為功能性益生乳桿菌的篩選提供參考。研究表明，疏水性與黏附性存在一定的相關性[10]，同時自聚集能力有助于生物膜形成，從而能夠抑制致病菌對人體腸道的侵襲，有助于促進人體健康。本實驗通過對10株不同植物乳桿菌的自聚集能力、表面疏水性和對Caco-2細胞的黏附性進行研究，評價其黏附能力的高低，探究黏附與表面性質的關系，為腸道益生乳桿菌的篩選和黏附機制的探討提供理論依據，同時通過對植物乳桿菌的化學處理，初步探討其黏附機制。

1 材料與方法

1.1 菌種、細胞與培養基

10株受試植物乳桿菌為實驗室保藏菌種，分離自新疆酸馬奶、酸駝奶、西藏靈菇，分別為：植物乳桿菌（Lactobacillus planturam，簡寫為L.p）AB1、L.p 3-4、L.p 9-5、L.p GCO10、L.p R2、L.p 3-1、L.p SR1-2、L.p A、L.p AB7、L.p M9-4。

人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞株，購自上海博谷生物科技有限公司。

MRS培養基采用參考文獻[11]的方法制備；高糖DMEM培養基、胰蛋白酶、雙抗（青霉素、鏈霉素溶液） 上海英駿生物技術公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；PHS-25型數顯pH計、離心機 上海精密科學儀器有限公司；凈化工作臺 上海新苗醫療器械制造有限公司；DNP-9272型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；101-1型電熱鼓風干燥箱 江蘇省東臺電器廠；PHS-2F型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌的自聚集能力測定

按照Collado[12]和Tuo Yanfeng[13]等的方法并做適當修改：10株植物乳桿菌分別以2%接種于滅菌后的液體MRS培養基中，37℃培養20 h。培養液4℃、10 000 r/min離心10 min，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次，然后重新懸浮于PBS中，調整細菌懸液濃度為107～108CFU/mL，取1 mL細菌懸液于600 nm波長處測定吸光度，記為A0，細菌懸液37℃靜置5 h后取1 mL上層清液至另一試管中，于600 nm波長處測定吸光度，記為At。通過公式（1）計算自聚集能力。重復進行3次獨立實驗，取平均值。

1.3.2 植物乳桿菌的表面疏水性測定

參考Rosenberg等[14]的方法，并略加修改：按照1.3.1節的方法制備細菌懸液，再加入等體積的二甲苯，該兩相體系渦旋混合3 min，37℃靜置1 h后取出上清液，于600 nm波長處測定水相的吸光度，記做A。按照公式（2）計算菌株的表面疏水性。重復進行3次獨立實驗，取平均值。

式中：A0和A分別表示植物乳桿菌懸液及兩相混合后水相的吸光度。

1.3.3 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附

1.3.3.1 細胞培養

從液氮罐中取出Caco-2細胞，將凍存管迅速置于37℃水浴中復蘇細胞，離心收集細胞后，加入5 mL DMEM完全培養液（含10%胎牛血清、1%雙抗）后，于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞生長狀況良好時（70%～80%融合），用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化傳代。細胞貼壁生長，隔天更換培養液，隔4 d進行傳代，傳代5次左右進行黏附實驗。

1.3.3.2 植物乳桿菌懸液的制備

10株植物乳桿菌分別按2%的接種量接種于MRS液體培養基中，37℃培養20 h，于4℃、1 000 r/min離心10 min收集菌體。用無菌PBS（pH 7.2）洗滌3次，將菌體重懸于不含血清和雙抗的DMEM培養液中，調整菌懸液的濃度為1×108CFU/mL。

1.3.3.3 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附觀察[15]

將細胞接種于含有蓋玻片的6 孔板中，于37℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液一次，待細胞長至單層時，用無菌PBS（pH 7.2）洗滌1次，每孔中加入1 mL 1.3.3.2節所制備的細菌懸液（1×108CFU/mL）孵育1 h。用無菌PBS洗滌5次，以除去未黏附的細菌。甲醇固定30 min，自然晾干后進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察植物乳桿菌的黏附情況。

1.3.3.4 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附計數

細菌、細胞培養與處理同前，除了將細菌懸浮液直接滴加于細胞培養孔中而不放置蓋玻片。經PBS洗滌后用1%的Triton X-100裂解10 min，梯度稀釋后平板計數。另選取長至單層的培養孔進行細胞計數。每個處理做3個平行，計算平均每個細胞黏附的細菌個數。

1.3.4 LiCl處理對植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的影響

10株植物乳桿菌分別以2%接種量接種于滅菌的液體MRS培養基中，37℃培養20 h。培養液4℃、10 000 r/min離心10 min，用pH 7.2的PBS清洗2次后懸浮于1/5體積的5 mol/L LiCl溶液中，冰浴處理30 min，PBS清洗2次后，重復1.3.1節和1.3.3.4節的步驟。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌的自聚集能力

圖1 植物乳桿菌的自聚集能力Fig.1 Autoaggregation ability of L.planturam strains

由圖1可知，10株不同植物乳桿菌之間的自聚集能力從8.33%到63.39%，差異顯著（P＜0.05）。10株植物乳桿菌中，植物乳桿菌SR1-2的自聚集能力最差為8.33%。其中6株植物乳桿菌自聚集能力達到20%以上，植物乳桿菌A的自聚集能力最強為63.39%，而植物乳桿菌AB1、植物乳桿菌9-5、植物乳桿菌GCO10、植物乳桿菌R2、植物乳桿菌M9-4的自聚集能力均在20%～30%之間。

2.2 植物乳桿菌的表面疏水性

圖2 植物乳桿菌的表面疏水性Fig.2 Cell surface hydrophobicity of L.planturam strains

由圖2可知，10株不同植物乳桿菌的疏水性有所差異，其中植物乳桿菌3-4的表面疏水性最高（P＜0.05），達到67.90%，其次是植物乳桿菌A和植物乳桿菌M9-4，表面疏水性分別為60.37%和59.34%，植物乳桿菌AB1、植物乳桿菌9-5和植物乳桿菌GCO10表面疏水性均在45%～50%之間，植物乳桿菌3-1、植物乳桿菌AB7表面疏水性均在30%～40%之間。植物乳桿菌SR1-2的疏水性最低，為12.99%。

2.3 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力

圖3 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力（×1 000）Fig.3 Adhesion of L.planturam strains to Caco-2 cells by Gram staining under a light microscope (×1 000)

由圖3可知，植物乳桿菌菌體形態完整，并且能夠黏附在Caco-2細胞的周圍，同時發現植物乳桿菌A（圖3a）和植物乳桿菌3-4（圖3b）黏附數量明顯高于其他植物乳桿菌，植物乳桿菌3-1（圖3c）和植物乳桿菌SR1-2（圖3d）對Caco-2細胞的黏附能力較差，這與黏附計數的結果一致（圖4）。同時發現植物乳桿菌A、植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌3-1對Caco-2細胞的黏附較為規則，能整齊地黏附在細胞周圍。

圖4 植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附分析Fig.4 Adhesion ability to Caco-2 cell of L.planturam strains

由圖4可知，不同植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力存在顯著差異（黏附數量為20.00～170.31，P＜0.05），其中植物乳桿菌SR1-2黏附數量最少，黏附能力最差，植物乳桿菌3-4黏附數量最多，黏附能力最強。10株實驗植物乳桿菌中，植物乳桿菌3-4、植物乳桿菌9-5、植物乳桿菌R2、植物乳桿菌A和植物乳桿菌M9-4對Caco-2細胞的黏附數量均高于100，植物乳桿菌GCO10和植物乳桿菌AB1對Caco-2細胞的黏附數量在90～100之間，其余植物乳桿菌的黏附數量在20～60之間，黏附能力較差。

2.4 植物乳桿菌表面性質和黏附能力的相關性分析

圖5 植物乳桿菌自聚集能力、表面疏水性和對細胞黏附能力的比較分析Fig.5 Comparative analysis of autoaggregation, cell surface hydrophobicity and adhesion ability of L.planturam strains

由圖5可知，植物乳桿菌的自聚集能力、表面疏水性和黏附能力存在一定的相關性。其中，表面疏水性與黏附能力存在顯著相關性（P＜0.05），表面疏水性高的植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力相應也高，表面疏水性低的植物乳桿菌對Caco-2細胞黏附能力也較低。如植物乳桿菌3-4疏水性最強，相應地對Caco-2細胞的黏附數量也最多，其次是植物乳桿菌A，疏水性較強，相應地對細胞的黏附數量也較多，而植物乳桿菌SR1-2表面疏水性最弱，相應地對細胞的黏附數量也最少，黏附能力最差。

由圖5可知，除植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌A以外，植物乳桿菌的自聚集能力與黏附能力也存在著一定正相關。自聚集能力強，細胞黏附數量較高，黏附能力也較強。植物乳桿菌3-4對Caco-2細胞的黏附數量最多，但其自聚集能力并不是最強的，而植物乳桿菌A的自聚集能力最強，但對Caco-2細胞的黏附數量卻不是最多的。說明植物乳桿菌的自聚集能力與細胞黏附能力的關系在菌株間存在著差異性。

2.5 LiCl處理對植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的影響

由圖6可知，與LiCl處理前的菌體細胞相比，經5 mol/L的LiCl處理后的菌體細胞自聚集能力明顯降低。

圖6 LiCl處理前后植物乳桿菌自聚集能力的變化Fig.6 Comparison of autoaggregation ability of L.planturam strains before and after LiCl treatment

圖7 LiCl處理前后植物乳桿菌對Caco-2黏附能力的變化Fig.7 Comparison of adhesion ability of L.planturam strains before and after LiCl treatment

由圖7可知，經5 mol/L的LiCl處理后，植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力也明顯降低。植物乳桿菌R2、植物乳桿菌3-1和植物乳桿菌SR1-2對Caco-2細胞的黏附數量幾乎為0，說明蛋白類物質在這3株植物乳桿菌的黏附過程中起著重要的作用。而其他植物乳桿菌對Caco-2細胞的黏附數與LiCl處理前相比，雖有不同程度的降低，但依然保持較多的細胞黏附數量，說明這些菌株對Caco-2細胞的黏附過程不僅有蛋白類物質起作用，還有其他因素的作用。

3 結論與討論

植物乳桿菌對腸道細胞的黏附和定殖是其發揮阻止外源病原菌入侵、清除腸道有害物質、保護胃腸黏膜等益生作用的先決條件。由于直接在體內研究植物乳桿菌對人腸道上皮細胞的黏附作用具有一定困難，因此本實驗以人結腸癌腺細胞系Caco-2為模型，采用顯微鏡觀察和平板計數的方法研究植物乳桿菌對細胞黏附狀態和數量的差異。結果發現10株植物乳桿菌對細胞的黏附能力存在菌株差異性，王麗群[16]和del Re[17]等對雙歧桿菌的黏附能力進行評價時，發現不同種類雙歧桿菌之間也存在著黏附能力的差異性，由此可見，黏附能力與植物乳桿菌的自身性質存在著必然聯系。

大量的研究結果表明，細菌的黏附能力與菌體表面性質存在較大的相關性[18-20]，研究黏附能力與表面性質的關系不僅可以通過表面性質快速篩選具有黏附性質的益生菌，同時可以初步判斷黏附機制。自聚集能力和表面疏水性通常被認為是反映菌體黏附能力的兩個特征。自聚集能力在細菌生物膜的形成過程中起著舉足輕重的作用，同時自聚集能力的大小也影響著乳桿菌在人體腸道內定殖情況，表面疏水作用對于乳桿菌在人體腸道的定殖具有良好的促進作用。本實驗選用10株植物乳桿菌，研究其黏附能力與自聚集能力和表面疏水性的關系。結果發現黏附能力與表面疏水性存在顯著相關性，這與陳臣等[5]的研究一致。此外，已有研究通過測定表面疏水性來間接反映細菌的黏附能力大小，細菌表面疏水性越大，則其黏附能力越強[21-22]。而黏附能力與自聚集能力的關系在菌株間存在差異性，與Tuo Yanfeng[13]和Vlková[23]等的研究結果一致。因此，自聚集能力和表面疏水性可作為篩選高黏附能力植物乳桿菌的參考指標。

黏附不僅涉及與表面性質有關的非特異性黏附，還包括與黏附素有關的特異性黏附[24]。與黏附有關的物質包括蛋白質、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或單糖等。本實驗發現經LiCl處理后的植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力均有所下降，表明蛋白類物質在植物乳桿菌自聚集和黏附過程中起到一定作用；除植物乳桿菌R2、植物乳桿菌3-1和植物乳桿菌SR1-2外，其余植物乳桿菌對Caco-2細胞仍有黏附作用，說明除蛋白質外，其他黏附素在黏附過程中起主要作用，其黏附機制和黏附素的確定有待進一步研究。

通過對10株從新疆酸馬奶、酸駝奶、西藏靈菇中分離的植物乳桿菌進行自聚集能力、表面疏水性和對Caco-2細胞的黏附能力研究，發現自聚集能力與黏附能力存在菌株之間的差異性，而表面疏水性和黏附能力之間存在顯著正相關，為高黏附植物乳桿菌的篩選提供了簡單、合理、有效的篩選方法。通過比較LiCl處理前后植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的變化，發現植物乳桿菌對細胞的黏附不僅與蛋白質有關，其他黏附因素也起到至關重要的作用。今后的研究將進一步確定與黏附有關的物質及黏附機制。此外，具有高黏附能力的乳桿菌有利于調節人體腸道健康，為食品應用及功能性食品的開發提供可能。實驗結果表明，植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌A具有良好的黏附能力，其表面黏附物質的屬性及在黏附中發揮作用的具體機制有待進一步研究。

[1]BAO Yan, ZHANG Yanchao, ZHANG Yong, et al.Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products[J].Food Control, 2010, 21(5): 695-701.

[2]吳淑清, 王順余, 譚克, 等.雙歧桿菌的研究現狀[J].長春大學學報,2007, 17(4): 57-61.

[3]陳思翀, 李禎禎, 陳芳.人體腸道益生菌的生理功能和安全性研究現狀[J].中國微生態學雜志, 2007, 19(4): 397-398.

[4]白潔, 李衛芬, 黃琴, 等.幾株益生乳酸菌對Caco-2細胞的黏附及其對致病菌黏附的影響[J].動物營養學報, 2012, 24(10): 1992-1998.

[5]陳臣, 郭本恒, 陳衛, 等.三株益生菌粘附性質及機制的初步研究[J].中國微生態學雜志, 2008, 19(6): 492-495.

[6]van LOOSDRECHT M C, LYKLEMA J, NORDE W, et al.The role of bacterial cell wall hydrophobicity in adhesion[J].Applied and Environmental Microbiology, 1987, 53(8): 1893-1897.

[7]OFEK I, DOYLE R J.Bacterial adhesion to cells and tissues[M].New York: Chapman & Hall, 1994: 82-96.

[8]LI Pengcheng, YIN Yinyan, YU Qinghua, et al.Lactobacillus acidophilus S-layer protein-mediated inhibition of Salmonella-induced apoptosis in Caco-2 cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 409(1): 142-147.

[9]陳臣, 郭本恒, 王蔭榆, 等.植物乳桿菌ST-Ⅲ黏附腸上皮樣細胞系Caco-2性質的研究[J].乳業科學與技術, 2008, 31(2): 51-55.

[10]REN Dayong, LI Chang, QIN Yanqing, et al.Inhibition of Staphylococcus aureus adherence to Caco-2 cells by lactobacilli and cell surface properties that influence attachment[J].Anaerobe, 2012,18(5): 508-515.

[11]RAMMELSBERG M, RADLER F.Antibacterial polypeptides of Lactobacillus species[J].Journal of Applied Bacteriology, 1990, 69(2):177-184.

[12]COLLADO M C, MERILUOTO J, SALMINEN S.Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains[J].European Food Research and Technology, 2008, 226(5): 1065-1073.

[13]TUO Yanfeng, YU Hanli, AI Lianzhong, et al.Aggregation and adhesion properties of 22 Lactobacillus strains[J].Journal of Dairy Science, 2013, 96(7): 4252-4257.

[14]ROSENBERG M, GUTNICK D, ROSENBERG E.Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity[J].FEMS Microbiology Letters, 1980, 9(1): 29-33.

[15]LIU Xiaoming, LIU Wenyu, ZHANG Qiuxiang, et al.Screening of lactobacilli with antagonistic activity against enteroinvasive Escherichia coli[J].Food Control, 2013, 30(2): 563-568.

[16]王麗群, 張佰榮, 王彥, 等.雙歧桿菌體外對Caco-2的黏附及其表面性質分析[J].微生物學報, 2010(5): 606-613.

[17]del RE B, SGORBATI B, MIGLIOLI M, et al.Adhesion,autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum[J].Letters in Applied Microbiology, 2000, 31(6): 438-442.

[18]COLLADO M C, MERILUOTO J, SALMINEN S.Measurement of aggregation properties between probiotics and pathogens: in vitro evaluation of different methods[J].Journal of Microbiological Methods, 2007, 71(1): 71-74.

[19]FERREIRA C L, GRZE?KOWIAK ?, COLLADO M C, et al.in vitro evaluation of Lactobacillus gasseri strains of infant origin on adhesion and aggregation of specific pathogens[J].Journal of Food Protection,2011, 74(9): 1482-1487.

[20]GUEIMONDE M, JALONEN L, HE Fang, et al.Adhesion and competitive inhibition and displacement of human enteropathogens by selected lactobacilli[J].Food Research International, 2006, 39(4): 467-471.

[21]MALDONADO N C, de RUIZ C S, OTERO M C, et al.Lactic acid bacteria isolated from young calves: characterization and potential as probiotics[J].Research in Veterinary Science, 2012, 92(2): 342-349.

[22]ZAGO M, FORNASARI M E, CARMINATI D, et al.Characterization and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains isolated from cheeses[J].Food Microbiology, 2011, 28(5): 1033-1040.

[23]VLKOVá E, RADA V, ?MEHILOVá M, et al.Auto-aggregation and co-aggregation ability in bifidobacteria and clostridia[J].Folia Microbiologica, 2008, 53(3): 263-269.

[24]GARCíA-CAYUELA T, KORANY A M, BUSTOS I, et al.Adhesion abilities of dairy Lactobacillus plantarum strains showing an aggregation phenotype[J].Food Research International, 2014, 57: 44-50.