核桃多肽對D-半乳糖誘導老年小鼠血脂水平的影響

楊子明，劉金磊，顏小捷，李典鵬*

（廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西 桂林 541006）

核桃（Juglans regia L.）原產于中亞，有胡桃、羌桃、合桃等別名，為“木本油料之王”，它與扁桃、開心果及榛子并列為世界四大干果[1-3]。核桃營養豐富，有補腎、溫肺、潤腸、強身健腦、駐顏延年功能，又稱“萬歲子”、“長壽果”、“益智果”、“美容果”，被歷代醫學家和養生學家視為益壽精品[4]。目前人們研究較多的是核桃油及核桃榨油后的核桃餅粕（富含核桃蛋白）的生物活性。有研究報道核桃油具有顯著降血脂和降低動脈粥樣硬化危險性的作用[5-7]，還具有抗氧化、抗衰老、提高記憶力、抗疲勞的作用[7-10]。樊永波等[11]發現核桃餅粕能明顯提高大鼠學習和記憶能力，改善大鼠的抗氧化功能，提高乙酰膽堿酯酶的活性；核桃蛋白還具有抑菌、抑制血管緊張素轉換酶以及抗腫瘤等生物活性[12]，但有關核桃蛋白及核桃多肽降血脂的研究尚未見報道，核桃多肽是核桃蛋白的酶解產物，其吸收率更好。蛋白質在動物體內以氨基酸或肽的形式被消化吸收[13]，近年來研究表明非單一氨基酸形式的小肽類具有重要的生理功能[14-17]。本實驗利用植物蛋白水解專用酶一、植物蛋白水解專用酶二、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶這幾種常用酶對核桃蛋白進行酶解，得到相應的核桃多肽，灌胃給予D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠，檢測其對血脂水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級BALB/c小鼠，體質量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。許可證號：SCXK（湘）2009-0004。

核桃餅粕 青島十相自在食品有限公司。

植物蛋白水解專用酶一（以下簡稱酶一）、植物蛋白水解專用酶二（以下簡稱酶二） 南寧東恒華道生物科技有限責任公司；木瓜蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶 江蘇銳陽生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C） 四川邁克生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）測定試劑盒 長春匯力生物技術有限公司；D-半乳糖 合肥Biosharp生物科技公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LG-500A十兩裝型高速中藥粉碎機 浙江瑞安市百信藥機器械廠；XS225A-SCS型電子天平 瑞士Precisa公司；HH-S型水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司；KQ 3200 DE型數控超聲波清洗器 昆山市儀器有限公司；CT-6023型pH計 深圳市柯迪達電子有限公司；TGL-16R型高速冷凍離心機 珠海黑馬公司；RT-9100型半自動生化分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃多肽的制備方法

核桃餅粕經粉碎過篩得到核桃粉，核桃粉經堿提酸沉得到核桃蛋白，核桃蛋白分別經酶一、酶二、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最佳酶解條件下酶解得到酶一核桃多肽（以下簡稱酶一組）、酶二核桃多肽（以下簡稱酶二組）、堿性核桃多肽（以下簡稱堿性組）、木瓜核桃多肽（以下簡稱木瓜組）。

1.3.2 老年小鼠模型的建立[18]

取BALB/c小鼠60 只，隨機分成6 組：對照組、模型組、酶一組、酶二組、堿性組、木瓜組。除對照組小鼠注射生理鹽水外，其余各組小鼠按1 500 mg/（kg?d）（以體質量計，下同）腹腔注射D-半乳糖，連續注射6 周。各給藥組小鼠按生藥量30 g/kg灌胃給藥，對照組和模型組小鼠灌胃等量的蒸餾水，每天1次，連續6 周。

1.3.3 血脂水平及抗氧化能力的測定

第42天（實驗末），小鼠禁食不禁水，稱體質量，取血4℃條件下保存備用。處死小鼠后，取大腦，用冰冷的質量分數0.9%的生理鹽水研磨制成勻漿液，離心取上清液，－20℃條件下保存備用。血脂水平及抗氧化能力指標的測定按試劑盒說明書方法進行操作。

1.4 數據處理及分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，實驗數據均以±s表示，兩個獨立樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本之間的兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 核桃多肽對小鼠體質量的影響

表1 核桃多肽對小鼠體質量的影響（±s，n＝10）Table1 Effect of walnut polypeptide on body weight in mice (±s,n= 10)

表1 核桃多肽對小鼠體質量的影響（±s，n＝10）Table1 Effect of walnut polypeptide on body weight in mice (±s,n= 10)

注：*.與對照組比較，差異顯著（P＜0.05）；**.與對照組比較，差異極顯著（P＜0.01）；#.與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）；##.與模型組比較，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別 初體質量/g 末體質量/g對照組 21.41±1.46 25.28±2.07模型組 21.84±1.46 26.08±1.68酶一組 22.28±1.40 25.69±1.35酶二組 23.13±1.47 27.09±1.25堿性組 21.57±1.18 27.10±0.86木瓜組 21.40±1.29 26.60±1.05

由表1可知，連續給藥第42天后，與對照組比較，模型組小鼠體質量沒有發生顯著變化（P＞0.05），說明D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型并不會使小鼠體質量減輕，單從體質量這個指標不能反應小鼠的衰老狀況，衰老指標需要從其他方面進行考慮；與模型組比較，核桃多肽各酶解組的小鼠體質量也沒有發生顯著變化（P＞0.05），說明核桃多肽對小鼠體質量沒有影響。

2.2 核桃多肽對小鼠血脂水平的影響

表2 核桃多肽對小鼠血脂水平的影響（±s，n＝10）Table2 Effect of walnut polypeptide on blood lipids in mice (±s,n= 10)

表2 核桃多肽對小鼠血脂水平的影響（±s，n＝10）Table2 Effect of walnut polypeptide on blood lipids in mice (±s,n= 10)

TC含量/TG含量/HDL-C含量/LDL-C含量/組別 （mmol/L） （mmol/L） （mmol/L） （mmol/L）對照組 1.94±0.30 1.73±0.33 1.17±0.08 1.38±0.16模型組 2.33±0.20* 2.05±0.29* 1.13±0.08 1.53±0.12*酶一組 1.88±0.22# 1.31±0.20## 1.23±0.09 1.36±0.17#酶二組 2.14±0.28 1.96±0.28 1.24±0.13 1.61±0.11堿性組 2.16±0.29 1.84±0.32 1.21±0.14 1.47±0.14木瓜組 2.22±0.22 1.77±0.45 1.38±0.12# 1.56±0.21

由表2可知，連續給藥42 d后，與對照組比較，模型組小鼠TC、TG、LDL-C含量升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；HDL-C含量降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），以上結果說明D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型小鼠血脂水平會升高，這與人體女性血脂研究結果相同，而與男性相反。據研究報道，男性血脂水平主要表現為TC和TG水平均隨著年齡的增加而降低，女性的TC和TG水平均隨著年齡的增加而升高[19]。與模型組比較，酶一組可降低小鼠的TC、TG、LDL-C水平，且差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，木瓜組能升高小鼠的HDL-C水平，差異具有統計學意義（P＜0.05）。酶二組、木瓜組、堿性組對小鼠的TC、TG、LDL-C水平均有一定的降低作用，但差異無統計學意義（P＞0.05）。由此可知，經植物蛋白水解專用酶一酶解的核桃多肽降脂效果最好，而其他幾種水解酶效果不好。這其中的原因可能與核桃多肽的溶解性有關，實驗中發現，經酶一酶解得到的核桃多肽溶解性最好，在灌胃給予小鼠后，吸收效果可能最好，因此其降脂效果也最好。

2.3 核桃多肽對小鼠血清抗氧化能力的影響

表3 核桃多肽對小鼠血清抗氧化能力的影響（±s，n＝10）Table3 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in serum of mice (±s,n= 10)

表3 核桃多肽對小鼠血清抗氧化能力的影響（±s，n＝10）Table3 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in serum of mice (±s,n= 10)

組別 SOD活力/（U/g） MDA含量/（nmol/g）對照組 140.44±15.66 7.80±0.64模型組 144.99±28.95 8.07±1.06酶一組 147.01±5.82 7.52±1.25酶二組 150.83±13.92 8.26±1.20堿性組 143.72±14.88 7.96±1.02木瓜組 160.35±14.27# 7.37±1.31

由表3可知，連續給藥42 d后，與對照組比較，模型組小鼠的血清SOD活力和MDA含量沒有發生顯著變化，這與前人的研究結果不同。張艷玲等[20]發現給Wistar大鼠注射D-半乳糖5個月，會導致大鼠血清SOD活力和MDA含量顯著下降；彭少君[21]發現給Wistar大鼠注射D-半乳糖6 周，也會導致血清SOD活力和MDA含量的顯著下降；在小鼠方面，顏燕等[22]給昆明小鼠注射D-半乳糖8 周，導致小鼠血清SOD活力和MDA含量的顯著下降；本研究的結果與前人不同，其原因可能是本研究所用的動物是BALB/c小鼠，與前人用的實驗動物不一樣，也可能是本實驗周期只有6 周，時間太短所致。與模型組比較，木瓜組能升高小鼠血清SOD活性，具有統計學意義（P＜0.05）；其余各組對SOD活力和MDA含量均沒有影響，說明核桃多肽對小鼠血清抗氧化能力的影響較小。

2.4 核桃多肽對小鼠大腦抗氧化能力的影響

表4 核桃多肽對小鼠大腦抗氧化能力的影響（±s，n＝10）Table4 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in brain of mice (±s,n= 10)

表4 核桃多肽對小鼠大腦抗氧化能力的影響（±s，n＝10）Table4 Effect of walnut polypeptide on antioxidant capacity in brain of mice (±s,n= 10)

SOD活力/（U/g）組別 T-AOC活力/（U/g）MDA含量/（nmol/g）對照組 76.67±5.90 300.16±19.31 95.28±12.39模型組 65.33±4.64* 267.99±36.95* 115.32±20.06*酶一組 100.27±11.08## 331.41±55.56# 66.97±16.52##酶二組 96.60±4.31## 325.44±63.62# 103.45±21.81堿性組 86.53±3.47# 299.80±33.09# 112.10±20.71木瓜組 88.53±4.60# 324.66±9.57# 108.37±22.38

由表4可知，連續給藥42 d后，與對照組比較，模型組小鼠大腦T-AOC、SOD活力下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），MDA含量升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；這與前人的研究結果相同[20-22]。自由基理論在解釋老年癡呆癥中占有非常重要的地位，實驗研究已經證實了自由基具有致衰老的作用，D-半乳糖誘導的衰老模型也得到了自由基學說的驗證[23-24]。本研究也證實D-半乳糖會導致小鼠大腦自由基紊亂，大腦抗氧化能力減退。與模型組比較，核桃多肽各酶解組均能升高小鼠大腦T-AOC、SOD活性，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，酶一組能降低小鼠大腦MDA含量，差異具有統計學意義（P＜0.01），其余各組也能降低MDA含量，但差異無統計學意義（P＞0.05）。以上結果說明核桃多肽各酶解組均能提高衰老小鼠大腦抗氧化能力，其中酶一組效果最好。有研究表明核桃餅粕（富含核桃蛋白）具有較好的抗氧化能力[11,25]，本研究證明核桃多肽具有較好的抗氧化能力，也證實了前人的研究結果。通過與前人研究結果對比，核桃多肽抗氧化能力強于核桃餅粕，其原因可能是核桃多肽的吸收率強于核桃蛋白，這也可能是酶一組抗氧化能力最強的原因。

3 結 論

綜上所述，核桃多肽具有降低D-半乳糖誘導老年小鼠血脂水平的作用，也可以提高其大腦抗氧化功能，說明核桃多肽具有較好的生物活性。核桃多肽相比于核桃蛋白，其溶解性更好、吸收性也更好，因此其降血脂、抗氧化功能也強于核桃蛋白。本實驗結果表明，經植物蛋白水解專用酶一酶解的核桃多肽水溶性最好，其降脂、抗氧化功能也最強，說明經植物蛋白水解專用酶一酶解的核桃多肽在動物體內吸收最好，能夠有效地發揮核桃蛋白的作用。

[1]SUETSUNA K, CHEN J.Isolation and characterization of peptides with antioxidant activity derived from wheat gluten[J].Food Science and Technology Research, 2002, 8(3): 227-230.

[2]郭從善.核桃及其加工與利用[J].糧油食品科技, 1999, 7(5): 23-25.

[3]崔莉, 葛文光.核桃蛋白質功能性質的研究[J].寧夏農學院學報,1999, 20(4): 44-48.

[4]李時珍(明).本草綱目(下冊)[M].北京:人民衛生出版社,1982: 1084.

[5]李建科, 張清安, 沈杰, 等.核桃油對小鼠血脂及膽固醇的影響[J].食品與生物技術學報, 2005, 24(5): 77-79.

[6]SABATE J, FRASER G E, BURKE K, et al.Effects of walnuts on serum lipid levels and blood pressure in normal men[J].New England Journal of Medicine, 1993, 328(9): 603-607.

[7]王克建, 郝艷賓, 齊建勛.核桃油研究進展[J].食品科學, 2004,25(11): 364-367.

[8]范學輝, 李建科, 張清安, 等.核桃油對小鼠體內抗氧化酶活性及總抗氧化能力的影響[J].西北農林科技大學學報: 自然科學版, 2004,32(11): 122-124.

[9]張清安, 李建科, 范學輝.核桃油對小鼠學習記憶能力的影響[J].陜西師范大學學報: 自然科學版, 2006, 34(4): 89-91.

[10]賈靖霖, 蒲云峰, 李虎, 等.核桃多肽抗疲勞作用的研究[J].食品工業科技, 2014, 35(7): 340-342.

[11]樊永波, 陶興無, 馬琳, 等.核桃餅粕對大鼠學習、記憶和抗氧化功能的影響[J].食品科學, 2013, 34(17): 323-326.doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317068.

[12]瞿夢新, 崔犁, 郭焱, 等.核桃蛋白生物活性的研究進展[J].中國食品與營養, 2013, 19(6): 62-64.

[13]NEWEY H, SMYTH D H.Intracellular hydrolysis of dipeptides during intestinal absorption[J].The Journal of Physiology, 1960,152(2): 367-380.

[14]雷萍, 金宗濂.幾種食物源性生物活性肽[J].食品研究與開發, 2004,25(6): 132-134.

[15]YAMAMOTO N, EJIRI M, MIZUNO S.Biogenic peptides and their potential use[J].Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(16):1345-1355.

[16]GILL L, POSINA L F, JORBA X, et al.Biologically active peptides and enzymat icapproaches to their production[J].Enzyme and Microbial Technology, 1996, 18: 162-183.

[17]陳貴堂, 趙霖.食物源生物活性肽及其營養生理價值[J].中國臨床營養雜志, 2005, 13(5) : 312- 315.

[18]許揚, 吳濤, 顧佳黎, 等.D-半乳糖誘導衰老動物模型研究進展[J].中國老年學雜志, 2009, 29(13): 1710-1713.

[19]楊中榮, 蔣善群, 秦獻輝, 等.安慶農村社區高血壓人群血脂與年齡的相關性[J].安徽醫科大學學報, 2010, 45(4): 512-517.

[20]張艷玲, 楊中華, 董碧蓉.大豆異黃酮對衰老大鼠抗氧化功能的影響[J].華西醫學, 2009, 24(5): 1183-1185.

[21]彭少君.葛根素抗衰老作用實驗研究[J].山東醫學, 2009, 49(20):45-46.

[22]顏燕, 郭婕, 楊非, 等.絞股藍、山楂提取物對D-半乳糖誘導的衰老模型小鼠抗氧化作用的實驗研究[J].實驗動物科學, 2009, 26(3):24-26.

[23]HARMAN D.Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry[J].Journal of Gerontology, 1956, 11(3): 298-300.

[24]陳嘉, 顧豐華, 劉翔, 等.石菖蒲水提取物SIPI-SCPd改善D-半乳糖誘導的癡呆模型小鼠學習記憶的研究[J].世界臨床藥物, 2013,34(1): 21-26.

[25]ARRANZ S, PéREZ-JIMéNEZ J, SAURA-CALIXTO F.Antioxidant capacity of walnut (Juglans regia L.): contribution of oil and defatted matter[J].European Food Research and Technology, 2008, 227(2):425-431.