神經根回植聯合細胞移植治療大鼠臂叢神經根性撕脫傷的作用

李曉濤 李長德 解云川 孫國娟 (佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

神經根回植聯合細胞移植治療大鼠臂叢神經根性撕脫傷的作用

李曉濤 李長德 解云川 孫國娟 (佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 研究神經根回植聯合細胞移植治療大鼠臂叢神經根性撕脫傷的治療作用。方法 隨機將實驗大鼠分成3組:A組(頸神經根撕脫組)、B組(頸神經根撕脫后回植組)、C組〔頸神經根撕脫后回植聯合神經干細胞(NSCs)與雪旺細胞(SCs)移植組〕;于術后不同時間點觀察實驗大鼠患肢功能恢復情況及相應脊髓損傷節段前角運動神經元的存活率。結果 術后1～8 w，B、C組患肢活動功能恢復情況較A組明顯改善;各組脊髓前角運動神經元存活率比較:A組＜B組＜C組，組間進行兩兩比較有顯著性差異(P＜0.05)。結論 神經根回植術聯合細胞移植能夠改善受傷大鼠的患肢功能，對損傷局部的神經元提供支持、保護和營養作用，可以挽救局部瀕死的神經元，減少損傷局部細胞的死亡。

神經干細胞;雪旺細胞;移植;臂叢神經

交通傷、高空墜落等高能量創傷較以往有大幅度增長，上臂叢神經根性撕脫傷患者上肢的功能將不同程度的喪失，以往臨床上多采取撕脫的神經根回植或其他神經移位等手術方法治療傷者，但療效一般。上世紀末，人們發現神經干細胞(NSCs)具有分化的潛能，這改變了之前的人們對中樞神經系統神經細胞不可再生的認識，也給為人們利用NSCs的移植治療神經系統疾病提供了新的思路。雪旺細胞(SCs)是周圍神經的膠質細胞，其功能活躍，能分泌多種神經營養因子，對周圍神經的生長、發育及功能的保持起到重要作用。當周圍神經損傷后，其對于神經的再生與修復也起到至關重要的作用。本研究通過實驗觀察NSCs與SCs共移植對臂叢神經根性撕脫傷大鼠患肢功能的影響以及損傷局部神經元的存活情況，綜合評價細胞移植的療效，進而闡明細胞移植治療作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠60只，鼠齡(60±5)d，體重(250±20)g，健康清潔級，隨機分為3組，每組20只，A組(頸神經根撕脫組)、B組(頸神經根撕脫后回植組)、C組(頸神經根撕脫后回植聯合NSCs與SCs移植組)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12、B27(Gibco公司)，小鼠抗大鼠BrdU抗體、小鼠抗大鼠Nestin抗體、FITC標記羊多克隆抗體(Sigma公司)，S-100抗體、鼠抗大鼠GFAP抗體、小鼠抗大鼠MAP-2抗體 、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實驗方法 A、B、C組均制備成臂叢神經根性撕脫傷模型，手術方法參照朱清遠等〔1〕的制備方法。方法如下:取頸椎后正中切口，依次切開皮膚、皮下組織及深筋膜，以C2及C7棘突確定椎體及神經根次序，沿中線向右側或左側分離棘突旁肌肉組織，手術顯微鏡下顯露硬脊膜和固定C5、C6、C7神經根，將C5、C6、C7神經根予以撕脫，操作應輕柔，然后將C6神經根殘端標記后埋于棘突旁肌肉組織內，再將撕脫的C5、C7神經根剪除1.5～2.0 mm后分別予以曠置。大鼠模型制備后1 w，A組局部顯露后注入與移植細胞同體積的生理鹽水;B組行神經根回植術并局部注入與移植細胞同體積的生理鹽水;C組行神經根回植及細胞移植術。神經根回植方法如下:沿原手術切口切開皮膚、皮下組織及深筋膜，以C2及C7棘突確定椎體及神經根次序，分離棘突旁組織，手術顯微鏡下將C6神經根斷端修整后插入相應節段頸髓硬脊膜下約0.8～1.0 mm深處，行神經外膜縫合。C組還要在神經根回植后行細胞移植。細胞移植方法如下:取微量注射器沿C6神經根的回植部位刺入脊髓，深度約1.0～1.5 mm。A組和B組注入5 μl生理鹽水，C組移植入Brdu標記后的5 μl NSCs和5 μl SCs。緩慢地將細胞懸液注入上述移植部位，注射速度為0.8～1.0 μl/min，細胞懸液中細胞密度約為1.0×106/μl。術后給予抗生素預防感染。于不同時間點觀察、記錄實驗動物患肢功能恢復情況、利用HE染色法計算大鼠相應脊髓損傷節段前角運動神經元的存活率。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 大體功能評價 術后1 w左右，可見少數大鼠開始出現手術側肘關節的屈曲動作，但大多數大鼠的活動幅度小于30°;隨著恢復時間的延長，大鼠手術側肘關節的屈曲動作有所恢復，至術后4～8 w時，B、C組手術側肘關節的屈曲功能恢復情況明顯優于A組，B、C組部分大鼠手術側肘關節的屈曲功能恢復至30°～60°，C組還有2只手術側肘關節的屈曲功能恢復至60°～90°。見表1。

2.2 脊髓前角運動神經元存活率的檢測 術后各時間點A組與其他兩組神經元存活率有顯著性差異(P＜0.05);B組C組有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

表1 各組患側肢體屈曲功能情況(n=20，n)

表2 各組脊髓前角運動神經元存活率(%，±s，n=3)

表2 各組脊髓前角運動神經元存活率(%，±s，n=3)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

組別1 w 2 w 4 w 8 w A組50.1±4.2 40.8±3.4 34.3±2.2 21.4±1.5 B 組 66.3±4.11) 52.4±3.11) 41.5±2.81) 38.1±2.41)C 組 78.1±5.21)2)76.4±3.41)2)73.2±3.11)2)68.3±2.21)2)

3 討論

臂叢神經根性撕脫傷是神經根的軸突在靠近細胞體處斷裂，神經根遠端開始發生Waller變性，另外受損的神經隨之發生逆向性變性，引起脊髓相應節段的神經元死亡，結果導致患側肢體出現嚴重的功能障礙，預后差。這需要臨床醫生與細胞生物學等相關學科的研究人員緊密配合，采取綜合性的治療手段〔2，3〕。以神經回植重建神經通路的連續性，再移植 NSCs與SCs用以激活損傷區域周圍處于休眠狀態的神經元，移植的細胞還能夠彌補局部缺失的神經元，保護、挽救受傷的神經元，以達到改善局部微環境、促進神經軸突的再生、神經元數量的恢復，最終使實驗動物的患肢功能得以改善。

對于建立臂叢神經根性撕脫傷動物模型，國內外學者所采取的方法不盡相同。Yamada等〔4〕采用神經移位的方法利用同側C3、C4神經根來修復損傷的C5、C6神經根，效果較好。本文采用經頸后正中切口，沿棘突旁作頸后肌群骨膜下剝離，切除一側半椎板，顯露椎管內、外神經根結構，采取切斷大鼠C5、C6、C7神經根，再把神經根近端撕脫，術后定期進行電生理學及肌肉功能等方面檢測，結果表明:上述制備臂叢神經根性撕脫傷動物的方法令人滿意。此方法的優點是手術操作相對簡單，術區出血少，術野清晰，不易損傷重要組織結構，神經根及脊髓顯露充分。本實驗表明:治療臂叢神經根性撕脫傷，神經回植術是局部修復的基礎，而細胞移植對于損傷的修復具有重要意義。

Nakamura等〔5〕把經體外擴增的人NSCs用TP標記后移植到臂叢根性撕脫傷獼猴的相應脊髓節段內，結果發現人的NSCs可以在獼猴體內存活、遷移，并且有部分細胞進行了分化，還觀察到獼猴患側上肢運動功能明顯優于對照組。本實驗提示，SCs對NSCs有支持、保護及營養作用，其在局部所形成的微環境更促進NSCs分化為有功能的神經元。本實驗說明在神經根回植術聯合NSCs與SCs移植能夠起到對損傷局部神經元的保護作用。

利用NSCs和SCs共移植治療臂叢神經根性撕脫傷的確切機制雖然還不甚明了，可能與下列因素有關:①通過神經根回植術，恢復損傷神經組織的解剖結構，修復受損的神經通路;②植入的NSCs在局部存活并產生諸如多肽類、神經營養因子類等細胞因子，這些細胞因子可以促進局部損傷神經組織的修復;③SCs與NSCs的共移植，SCs為NSCs提供生長、發育所需要的骨架，為NSCs提供生長所必需的多種神經營養因子。此外，SCs還能參與構成有利于NSCs向功能神經元方向分化的微環境。

1 朱清遠，王玉發，王國君，等.臂叢神經根性撕脫傷動物模型的實驗研究〔J〕.吉林醫學，2003;24(2):133-5.

2 Reinebrant HE，Wixey JA，Gobe GC，et al.Differential effects of neonatal hypoxic-ischemic brain injury on brainstem serotonergic raphe nuclei〔J〕.Brain Res，2010;1322:124-33.

3 Naghdi M，Tiraihi T，Namin SA，et al.Transdifferentiation of bone marrow stromal cells into cholinergic neuronal phenotype:a potential source for cell therapy in spinal cord injury〔J〕.Cytotherapy，2009;11(2):137-52.

4 Yamada S，Peterson GM，Soloniuk D，et al.Coaptation of the anterior rami of C3 and C4 to the upper trunk of the brachial plexus for cervical nerve root avulsion〔J〕.J Neurosurg，1991;74(2):171-7.

5 Nakamura M，Toyama Y，Okano H.Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2005;45(11):874-6.

R74

A

1005-9202(2015)09-2331-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.011

黑龍江省自然科學基金(H201359);黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12521538)

孫國娟(1976-)，女，主管護師，主要從事脊柱外科患者圍術期護理的研究。

李曉濤(1974-)，男，博士，副主任醫師，主要從事周圍神經損傷與修復研究。

〔2013-12-19修回〕

(編輯 張 慧)