電針對繼發性脊髓損傷后大鼠神經元自噬及相關蛋白輕鏈3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表達的影響

楊 波 隋汝波 (遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121000)

電針對繼發性脊髓損傷后大鼠神經元自噬及相關蛋白輕鏈3Ⅱ和bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3表達的影響

楊 波 隋汝波 (遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121000)

目的 觀察電針治療對大鼠繼發性脊髓損傷(SCI)后神經元自噬及相關蛋白表達的影響。方法 健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、西藥組(甲潑尼龍治療)及電針組(電針大椎、命門穴治療)4組;除對照組外，其他3組均采用改良的Allen打擊裝置(50 g/cm)復制大鼠T10～11中度SCI模型。分別于SCI后6 h、1 d、7 d取損傷局部脊髓組織，經透射電子顯微鏡及Western印跡法，觀察各組SCI后神經元自噬的病理變化及輕鏈(LC)3Ⅱ、bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3的表達。結果 ①SCI后1 d脊髓組織中LC3Ⅱ、BNIP3表達明顯升高(P＜0.01);電針組和西藥組SCI后脊髓組織中LC3Ⅱ、BNIP3的表達顯著降低，與模型組差異顯著(P＜0.01);西藥組與電針組差異不顯著(P＞0.05)。②在透射電鏡觀察下，對照組脊髓組織神經元細胞核膜完整，胞質中線粒體形態分布及數目正常，未發現自噬小體，溶酶體數目也未見增多;模型組脊髓組織可見線粒體腫脹明顯、空泡化，溶酶體數量增多，細胞核形不規則，可發現自噬小體;西藥組和電針組可見脊髓組織神經元細胞腫脹，線粒體也略腫脹，核形規則，核內染色質欠均勻，溶酶體數目未見明顯增多。結論 電針可降低SCI大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ和BNIP3的表達，抑制細胞自噬，減緩脊髓損傷后的病理損害，其作用與甲潑尼龍相仿。

脊髓損傷;電針;自噬;輕鏈(LC)3Ⅱ;bcl－2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3

脊髓損傷(SCI)大多源于交通事故、運動意外和暴力〔1，2〕。目前皮質類固醇激素類藥物是唯一被美國聯邦食品藥品管理局批準治療SCI的藥物〔3〕，并取得了一定的臨床療效，但大劑量或長期使用會引起諸多不良反應〔4〕。近年來研究發現，電針可以阻止或減輕SCI后的繼發性損害，促進脊髓的修復和再生〔5，6〕。繼發性SCI的主要機制為凋亡和自噬。電針對SCI后脊髓細胞凋亡的研究已有眾多的報道〔7，8〕，但是到目前尚無關于電針對SCI后脊髓細胞自噬影響的研究。本實驗探討電針干預對繼發性SCI大鼠神經細胞自噬及自噬相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 分組及動物模型復制〔9〕選用成年SD大鼠40只，體重250～300 g，雌雄兼有。大鼠給予自由飲水和進食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活動時間。隨機分為4組，每組10只，為對照組、模型組、西藥組(甲潑尼龍治療)和電針組(電針大椎、命門穴治療)。除對照組外，其他3組采用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔麻醉，俯臥位固定于自制的弓形手術臺上，以微型咬骨鉗咬除T9～11棘突和椎板，暴露脊髓，但不損傷硬脊膜。采用自制的Allen改良式打擊裝置，高度為5 cm，致傷量為50 g/cm，造成T10～11節段急性SCI(此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷)。雙下肢及背部肌肉瞬時收縮，硬脊膜下出血，鼠尾持續劇烈擺動數秒，麻醉醒后雙下肢表現為不完全癱瘓，提示造模成功。

1.2 治療模型制作 電針組是在造模大鼠蘇醒后先行聯合行為評分(CBS)，再選取大椎(第7頸椎棘突下，向下斜刺)、命門(第2腰椎棘突下，向上斜刺)進行針刺治療，進針約0.5～0.7 cm。使用韓氏LH-202H型穴位神經刺激儀，大椎穴接陰極，命門穴接陽極，持續脈沖電流，頻率2 Hz，治療時間20 min，輸出強度在剛開始時以背部肌肉出現輕微抽動為度，待其適應后則以雙下肢癱瘓肌肉出現有節律的收縮為度。電針組每天同一時間重復治療一次。西藥組于造模后以30 mg/kg體重的甲潑尼龍尾靜脈注射。第2天同一時間以5.4 mg/kg體重的甲潑尼龍尾靜脈重復注射1次，之后再不給藥。對照組和模型組不做任何治療，但要在同一時間均抓取一次，以保證應激條件相同。

1.3 透射電鏡觀察 各組成模后7 d腹腔注射4%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，自左心室灌注生理鹽水，4%多聚甲醛-5%戊二醛灌注固定，損傷脊髓后角取約1 mm3的組織，磷酸緩沖液漂洗，1%餓酸后固定1 h，酒精、丙酮逐級脫水，環氧樹脂618包埋，甲苯胺藍染色后定位，超薄切片(60 nm)，醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色，透射電鏡下觀測。

1.4 Western印跡檢測 麻醉方法同上，在不同時間點，迅速取出長約10 mm包括損傷區域的脊髓組織，組織蛋白提取試劑提取脊髓總蛋白，二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度，相同質量的樣品(40 μg)，4～12%NuPAGE凝膠恒壓分離，濕轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉1 h，兔抗微管相關蛋白1輕鏈(LC)3多克隆抗體(1∶500)，兔抗基因bcl-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白(BNIP)3多克隆抗體(1∶200)和小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，分別加入HRP標記山羊抗兔和HRP標記山羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，化學發光液顯影。Western印跡結果用掃描分析軟件系統(Labworks Analysis Software，美國)測定各條帶的積分灰度值，以目的蛋白與β-actin蛋白產物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結果

2.1 透射電鏡觀測神經元自噬 對照組脊髓組織神經元細胞核膜完整，胞質中線粒體形態正常(箭頭所示)，未發現自噬小體，溶酶體數目也未見增多。模型組可見線粒體腫脹明顯、空泡化，溶酶體數量增多，細胞核形不規則，可發現自噬小體。西藥組和電針組可見脊髓組織神經元細胞腫脹，線粒體略腫脹，核形規則，核內染色質欠均勻，游離核糖體及溶酶體數目未見明顯增多。見圖1。

圖1 各組7 d后神經元超微結構

2.2 Western印跡檢測LC3Ⅱ的表達 LC3Ⅱ在對照組幾乎不表達，在SCI后6 h，1、7 d 3個時間段，模型組脊髓組織中LC3Ⅱ表達均升高，與對照組差異顯著(P＜0.01)，并且在損傷后1 d達到高峰;電針組與西藥組均可降低LC3Ⅱ表達水平，與模型組差異顯著(P＜0.01)。見圖2、表1。

2.3 Western印跡檢測BNIP3的表達 BNIP3在SCI后6 h明顯升高，1 d后達到高峰(P＜0.01)，7 d后又下降至對照組水平，電針組與西藥組均可降低LC3-Ⅱ表達水平，與模型組差異顯著(P＜0.01)。見圖2、表1。

圖2 各組LC3Ⅱ、BNIP3表達Western印跡檢測結果

表1 半定量分析不同損傷時間點LC3Ⅱ、BNIP3表達(n=10，±s)

表1 半定量分析不同損傷時間點LC3Ⅱ、BNIP3表達(n=10，±s)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

BNIP3組別 LC3Ⅱ6 h 1 d 7 d 6 h 1 d 7 d對照組 0.046 4±0.010 2 0.048 7±0.015 2 0.042 7±0.016 20.077 3±0.012 5 0.068 9±0.017 2 0.062 7±0.018 4模型組 0.146 6±0.026 41) 0.512 6±0.056 21) 0.365 5±0.023 21) 0.275 4±0.043 41) 0.441 7±0.065 81) 0.285 8±0.053 51)西藥組 0.086 9±0.011 42) 0.079 8±0.009 22) 0.295 6±0.008 7 0.157 8±0.012 52) 0.179 7±0.009 52) 0.096 7±0.011 62)電針組 0.157 8±0.012 2 0.144 7±0.013 42) 0.123 7±0.009 62) 0.157 8±0.012 82) 0.144 7±0.013 62) 0.083 7±0.010 32)

3 討論

SCI后的病理損害分為原發性SCI和繼發性SCI〔10〕。前者是在受傷瞬間暴力直接或間接作用于脊髓所造成的傷害，屬不可逆損傷;后者則是由前者引發的一系列神經病理變化(如脊髓缺血、缺氧、水腫及神經細胞變性壞死等)，采用治療手段可影響它的發生和發展，屬可控性損傷，所以目前研究的焦點主要是繼發性 SCI〔11〕。

神經細胞自噬是繼發性SCI的重要組成部分。很多研究也證實，繼發性SCI廣泛存在著神經細胞自噬現象〔11〕。自噬發生的過程是一系列自噬性結構逐漸演變的過程，自噬被誘導上調后，在細胞內形成隔離膜，并與需降解的胞質成分集結在一起，然后隔離膜延伸并包裹封閉胞質成分形成一個雙層膜的結構，即自噬小體，自噬小體與溶酶體直接融合形成自噬溶酶體，最終在溶酶體酶的作用下被降解利用〔12〕。透射電鏡是觀察自噬現象的最直接、最經典的方法，而電鏡檢測自噬主要目的是辨認自噬小體的結構〔13〕。

Kanno等〔13〕也在SCI后3 d時使用透射電鏡觀測到了自噬小體，這與本實驗結果基本一致，但Kanno等〔13〕的電鏡圖片沒有區分損傷細胞的類型以及基本結構，而本文圖片重點觀察了細胞的超微結構。本文結果表明，電針組和西藥組的鏡下病變明顯輕于模型組，并且恢復較好，兩組均可減輕SCI后脊髓組織神經細胞的自噬。

自噬過程由一系列自噬相關蛋白介導完成。LC3是自噬體膜上的標記蛋白，當未發生自噬時，細胞內合成的LC3經過加工，成為胞質可溶性的LC3Ⅰ，常規表達;當自噬啟動時，LC3Ⅰ經泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3Ⅱ〔13，14〕。LC3Ⅱ與 BNIP3二聚體上的 LC3結合區域結合參與誘導自噬〔14〕。

Kanno等〔13〕通過免疫熒光觀測發現SCI后脊髓組織LC3Ⅱ和BNIP3的表達也升高，這與本研究的檢測結果相符。正常的神經細胞中不能檢測到 BNIP3，但是SCI后神經細胞缺血、缺氧時誘發自噬，導致BNIP3表達增高，本實驗中也證實了SCI后BNIP3表達增高。另外，本結果另一個有意義的發現是電針治療可以顯著降低SCI后神經細胞LC3Ⅱ和BNIP3的表達，其作用和西藥組相當。因此，電針可以通過調節不同時間段的LC3Ⅱ和BNIP3表達而阻斷自噬信號的傳導，抑制自噬，從而對神經細胞保護起到重要作用。

綜上，電針治療可以降低大鼠SCI后脊髓組織中LC3Ⅱ和BNIP3的表達，抑制神經細胞自噬，減緩SCI后病理損害。

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R683.2

A

1005-9202(2015)09-2339-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.014

遼寧省教育廳一般項目(No.L2012311)

楊 波(1975－)，男，碩士，副主任醫師，主要從事神經系統疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(編輯 苑云杰)