海南美登木提取物調節人肝癌細胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表達

宮愛民 李鑫元 楊世忠 馮 釗 (海南醫學院，海南 海口 57000)

海南美登木提取物調節人肝癌細胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表達

宮愛民 李鑫元1楊世忠 馮 釗 (海南醫學院，海南 海口 571000)

目的 分析海南美登木提取物調節人肝癌細胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表達。方法 應用體外細胞培養及RT-PCR法分析海南美登木提取物作用后肝癌細胞中凋亡基因p53、Fas及細胞增殖基因bcl-2表達。結果 海南美登木提取物能對人體內腫瘤細胞進行誘導和分化，并且能夠有效抑制腫瘤細胞DNA合成;細胞周期G0/G1期能夠有效誘導細胞凋亡;經濃度為5、10 mg/L海南美登木對提取的癌細胞進行24、36及72 h處理，可以發現很多野生型p53基因，但是未發現Fas及bcl-2基因。結論 海南美登木與患者體內誘導野生型p53基因關系密切，它能夠有效清除患者體內惡變細胞，提高患者身體功能。

海南美登木提取物;p53;bcl-2基因;凋亡

人體的造血、免疫和腫瘤發生機制都受細胞凋亡的影響。Fas屬于常見的腫瘤壞死因子(TNF)，它屬于轉移膜受體(TNF/NGF)超家族，當這種因子受到抗體及配體等刺激時，會誘導FasL死亡〔1〕。細胞在凋亡過程中p53與bcl-2基因都發揮重要作用。一方面，p53能夠有效地促進細胞凋亡，而bcl-2基因則能抑制細胞的凋亡〔2〕。美登木屬(Maytenus)植物主產于熱帶及亞熱帶地區〔3〕，海南美登木(M.Hainanensis)性辛、苦、溫，歸肝經，具有活血消癥功效，是臨床上用于治療肝癌有效的海南民族中草藥，自20世紀70年代開始，相繼從美登木屬植物中分離提取到美登素、美登普林和美登布丁等抗腫瘤活性成分，并通過多年的實驗研究及臨床應用，證明其抗實驗動物瘤譜廣、有效劑量低、安全系數大，臨床實驗的結果表明美登木屬植物可治療肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤〔4，5〕。腫瘤的發生、發展與腫瘤細胞的凋亡有密切關系，通過誘導癌細胞凋亡來治療各種惡性腫瘤是目前研究的熱點〔6〕。研究表明〔7〕:活血消癥中藥抗腫瘤作用亦多從凋亡途徑進行深入研究。本研究選擇人肝癌HepG2細胞，觀察海南美登木含提取物對人肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材、主要儀器 海南美登木，產地海南，購自萬寧藥用植物研究所。光學成像顯微鏡 (上海光學儀器廠);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術公司);MCO-17AICO2培養箱(日本SANYO公司);倒置顯微鏡 (上海光學儀器廠);酶標儀(DG3022A日本產);旋轉蒸發器(DF-101S上海予正儀器設備有限公司);多功能細胞分析系統(Becton Dickinson FACSort美國產);純水機:深圳產 SYJ-6HD400GHL;熒光顯微鏡 (德國Leica公司)。焦碳酸乙二脂(DEPC)，隨機引物(Oligo〔dT〕15引物)，脫氧核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，脫氧核苷三磷酸(dNTP)均為 Promega產品，反轉錄酶(M-MuLV reverse transcriptase)為MBI fermentas產品，TaqDNA聚合酶(5 U)、PCR擴增緩沖液為上海生工(Sangon)產品，內切酶 HincⅡ為日本(TOYOBO)公司產品，PCR熱循環儀(Perkin-Elmer公司)，紫外光度儀(Amersham PharmaciaBiotech公司，Gene QuantTMⅡRNA/DNA Calculator型)。

1.2 引物序列 按文獻〔8〕及GenBank庫中p53基因序列設計了兩條引物:p1:5′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′，p2:5′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295 bp)。按文獻〔1〕設計了 bcl-2及 Fas基因序列:bcl-2為 5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC， 3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348 bp);Fas 為 5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC，3′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342 bp)。

1.3 主要試劑 優等胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI1640(美國Gibco公司);DMSO、MTT測定試劑盒 、Hoechst33258熒光染料 、碘化丙啶(美國Sigma公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(上海信然生物科技有限公司)等。

1.4 海南美登木提取物制備 用12、10、8倍量的水分別提取20 g藥物1.5、1、1 h，合并過濾后的濾液，加入 95% 乙醇，使乙醇含量達80%，棄去放置過夜的上清液，冷凍干燥所收集的沉淀，制成凍干粉〔9〕。

1.5 細胞株及培養 人源肝癌細胞HePG2，上海中醫藥大學肝病研究所贈予;海南醫科大學病理生理實驗室保存。實驗中將10%滅活胎牛血清放在細胞培養皿中培養過程中放入100 mg/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素，培養皿溫度控制在37℃，培養過程中每3 d更換一次液體。

1.6 藥物處理 用海南美登木提取物處理細胞，實驗中藥物濃度分別設置為5、10 mg/L，并且設對照組，藥物在使用過程中對藥物進行離心。

1.7 總RNA提取并反轉錄 對于細胞質總RNA的提取參考文獻〔10〕。實驗中搜集兩次PBS溶液，并且在200 μl RNA中提取緩沖液，并對這些緩沖液進行離心，舍去未分裂的細胞和細胞下層的沉淀物，而離心上層則使用50 mg/L的蛋白酶K，溫度控制在37℃，時間控制在30 min。然后，向分離的液體中加入1體積的水飽和酚和0.2體積的氯仿:異或醇(24∶1)對所得的液體再次進行離心，讓其沉淀RNA，并在溫度為-20℃下放置至少1 h，用70%的乙醇洗一遍，真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20 μl的反轉錄緩沖液中加 2 μl單鏈〔dT〕15引物，2.5 μl dNTP(各 10 mmol/L)，0.5 μl RNasin(1 000 U/ml)，然后，70℃加熱5 min，冰上冷卻。簡短離心后加 1.2 μl Moloney MuLV病毒反轉錄酶(GIBCO公司)并37℃下保溫1 h，90℃變性5 min，得到的cDNA樣品保存于-70℃。

1.8 PCR的擴增 采用0.2 ml的基因中共包含以下成分，即:2.5 μl cDNA，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 5′→3′核苷酸引物及2.5 U Taq酶(Sangon)。PCR 反應時共進行30個循環，并且在94℃時保持30 s，每一個引物退火后控制在72℃中保持2 min。對于PCR的產物在檢測過程中可以使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且設對照組。

2 結果

海南美登木提取物能夠對人體內的腫瘤細胞進行誘導和分化，并且能夠有效地抑制腫瘤細胞DNA的合成，并且實驗結果還顯示:從細胞周期的G0/G1期能夠有效地誘導細胞的凋亡，實驗過程中可以采用濃度為5 mg/L、10 mg/L的海南美登木處理癌細胞，對樣本進行24 h、36 h及72 h檢查，結果可以發現很多野生型 p53 基因(Fig.1:4、7 號泳道，Fig.2:2、3、4、5 號泳道)，但是卻并沒有發現 Fas及 bcl-2 等基因(Fig.1:2、3、4、5、6 號泳道，Fig.2:6、7、8、9、10、11、12、13 號泳道)。見圖 1，圖 2。

圖1 RT-PCR分析肝癌細胞中p53，bcl-2與Fas mRNA水平(24 h)

圖2 RT-PCR分析肝癌細胞中p53，bcl-2與Fas mRNA 水平(36，72 h)

3 討論

p53基因是臨床上研究較多的抑制基因，和腫瘤等有著緊密的聯系。野生型p53是典型的抗腫瘤基因，但是這種物質的突變型則不但不會抑制腫瘤的發生，甚至會促進腫瘤生長而變為癌基因〔8，11，12〕。醫學界普遍認為:p53基因是癌癥患者中比較常見的突變基因。肝癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發現并檢測出了p53基因，并發現了一種新型基因bcl-2，該基因表達能力較強，能夠誘發腫瘤，并且能夠準確計算出腫瘤細胞的生存期〔13，14〕。

海南美登木活血化瘀，含抗癌活性成分的美登木素和美登布林有直接殺死癌細胞的作用。根據過去相關實驗結果顯示:海南美登木后藥物能夠對患者免疫起到調節作用，能夠保護患者肝臟，且藥物能夠促進腫瘤細胞加速分化，對腫瘤細胞DNA的合成等具有較強的抑制作用。并且實驗結果還顯示:海南美登木從細胞周期的G0/G1期開始誘導腫瘤細胞凋亡。從這些實驗等中都可以看出海南美登木提取物的作用機制和在腫瘤患者體內發揮的作用〔15〕。本實驗結果顯示，在腫瘤細胞凋亡過程中，基因p53表達能力會增強。但是在細胞分化和增殖過程中bcl-2等基因卻沒有得到表達。海南美登木提取物在p53基因中能夠有效清除患者體內的癌細胞，增強患者機體免疫，但是相關機制仍然需要研究。

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3 Hideji I，Osamu S，Hiroshi I，et al.Triterpenes from maytenus ilicifolia〔J〕.Phytochemistry，1991;30(11):3713-6.

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R73

A

1005-9202(2015)09-2370-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.026

海南省自然科學基金資助項目(No.811205;811207)

1 哈爾濱醫科大學

楊世忠(1952-)，男，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合治療肝膽病研究。

宮愛民(1975-)，男，主任醫師，博士，主要從事中醫四診客觀化、肝膽病研究。

〔2013-12-16修回〕

(編輯 苑云杰)