重組人促紅細胞生成素對心肌梗死大鼠腫瘤壞死因子－α表達的影響

邢 軍 白佳寧 蔡長華 (遼寧省人民醫院麻醉科，遼寧 沈陽 006)

重組人促紅細胞生成素對心肌梗死大鼠腫瘤壞死因子－α表達的影響

邢 軍 白佳寧1蔡長華 (遼寧省人民醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110016)

目的 探討重組人促紅細胞生成素(rhEPO)對心肌梗死(MI)大鼠心肌腫瘤壞死因子(TNF)－α表達的影響。方法 45只SD大鼠，隨機分為假手術組(Sham組)、MI組和rhEPO治療組。用ELISA方法檢測各組大鼠血清中TNF－α水平，RT－PCR方法檢測梗死區及其周圍心肌TNF－α mRNA表達變化。結果 MI組血清中TNF－α水平、梗死區及其周圍心肌TNF－α mRNA表達顯著高于Sham組(P＜0.05);與MI組相比，rhEPO治療組血清中TNF－α水平、梗死區及其周圍心肌TNF－α mRNA表達明顯降低(P＜0.05)。結論 rhEPO可能通過下調TNF－α改善MI大鼠的心功能。

重組人促紅細胞生成素;心肌梗死;腫瘤壞死因子－α

心肌梗死 (MI)時，心肌細胞出現不可逆的液化性壞死，喪失正常的泵血功能，最終可導致心力衰竭 (HF)的發生。目前對于MI的治療方法，只能恢復梗死區早期再灌注改善心肌供血，但不能修復或逆轉已壞死的心肌。促紅細胞生成素 (EPO)是調節紅細胞生成的糖蛋白，刺激骨髓的造血干細胞向紅細胞分化〔1〕。EPO的生物學效應是通過激活特異性EPO受體并啟動相應的信號傳導途徑來實現的〔2〕。重組人EPO(rhEPO)含有與天然分離的EPO完全相同的氨基酸序列，且具有相同的生物學活性，研究發現，它能夠對機體供氧狀況發揮重要的調控作用〔3〕，在臨床應用EPO治療貧血合并充血性HF患者，可觀查到患者的心功能得到了顯著改善〔4〕，但是其具體作用機制尚待進一步研究。腫瘤壞死因子(TNF)－α是體內的一個重要炎性因子，能夠激發細胞因子網絡，繼而造成細胞因子的級聯反應，進而誘生其他的炎性介質從不同的環節參與炎性反應，引起器官組織損傷，是炎癥反應的一個重要啟動因子〔5〕，研究發現，在人類HF中，抗TNF－α治療可以減輕或逆轉左室重塑和心室擴張〔6〕，但是，rhEPO能否通過調節TNF－α的表達參與MI的炎性機制尚未見文獻報道，本研究觀察MI大鼠的血清和梗死及周圍區域組織的TNF－α的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 rhEPO注射液(沈陽三生制藥有限公司);大鼠TNF－α ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，DH－150動物人工呼吸機(浙江大學醫學儀器廠)，Med lab－U/4CS生物信號采集儀(南京美易科技有限公司)，高速離心機(上海醫用分析儀器廠)，OLYMPUS光學顯微鏡(日本Olympus公司)，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司)。

1.2 動物模型的建立及分組 SD大鼠45只(由中國醫大動物室提供)，隨機分為3組:假手術組(Sham組)、rhEPO治療組、MI組。方法參考馬驥等〔7〕大鼠經水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥固定于手術臺板上，行頸部切開氣管并插管，用動物人工呼吸機進行人工呼吸，于第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟、血管。在肺動脈圓錐和左心耳之間結扎左冠狀動脈前降支，此時可見到左冠狀動脈前降支供血區域變白，結扎成功標志為左心室前壁顏色變白和運動減弱。仔細檢查心臟無出血時關胸。待動物出現吞咽動作后拔除氣管插管。手術后腹腔內注射青霉素40萬U以預防感染，并在30℃條件下蘇醒。其中rhEPO治療組結扎冠狀動脈同時，術后每天腹腔注射rhEPO(1 000 U/kg);MI組結扎冠狀動脈，并從術后每天腹腔注射等量的生理鹽水，Sham組只開胸，不給予藥物，術后給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.3 ELISA方法檢測大鼠血清TNF－α含量 給藥30 d后，處死大鼠，股動脈采血，采用酶聯免疫試劑盒檢測血清TNF－α含量，嚴格按照說明書完成。

1.4 RT－PCR方法檢測 麻醉處死各組大鼠，冰上取出大鼠心臟，迅速凍存于－70℃冰箱備用。按RNAout說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉錄(RT法)先合成cDNA，再進行PCR擴增;TNF－α 上游引物:5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′;下游引 物:5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，擴 增 產 物 全 長255 bp。β－actin 的上游引物:5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC3′;下游引物為:5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，擴增產物全長374 bp。擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。用目的基因與β－actin光密度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.5 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 動物模型制作結果 術后3 d，MI組與rhEPO治療組大鼠食欲低下，活動量明顯減少，Sham組飲食行動正常。第30天，MI組大鼠死亡4只，rhEPO治療組死亡1只，假手術對照組無死亡大鼠。

2.2 血清TNF－α表達含量變化 MI組的血清TNF－α表達為(46.95±18.69)pg/ml，與 Sham 組(19.42±6.25)pg/ml相比顯著升高(P＜0.05);與 MI組相比，rhEPO治療組(38.12±12.39)pg/ml的 TNF－α 表達顯著降低(P＜0.05)。

2.3 RT－PCR結果 MI組大鼠心肌梗死區及周圍組織的TNF－α mRNA 和 β－actin mRNA 的光密度比值為(0.51±0.25)，與Sham組(0.22±0.01)相比顯著升高(P＜0.05);與 MI組相比，rhEPO治療組大鼠MI區及周圍組織的TNF－α mRNA和βactin mRNA的光密度比值(0.39±0.22)明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織TNF-α mRNA表達

3 討論

MI后，將導致血供不足，最后造成有功能的心肌細胞減少以及心室重構，最終導致HF，而心肌細胞凋亡則是MI的重要特征之一〔8〕。EPO是一種含唾液酸的酸性糖蛋白激素，具有抗炎和免疫調節作用，在以往血液透析病人的EPO治療中，發現長期應用 EPO 可使病人體內干擾素－γ(INF－γ)、TNF－α、白介素－6(IL－6)和白介素－8(IL－8)等致炎因子降低，而使抗炎因子白介素－10(IL－10)升高〔9〕，研究發現，促紅細胞生成素通過上調抗凋亡蛋白Bcl－XL的表達而抑制促凋亡因子細胞色素C的釋放，進而阻止Apaf－1降解物與細胞色素C結合所誘導的促凋亡蛋白酶Caspase－9的活化，從而起抗內皮細胞凋亡作用，保護血管內皮〔10〕，另有研究發現，EPO能夠增加缺血處心肌細胞耐受缺氧的能力〔11〕，但是其具體的作用機制尚待進一步研究。

TNF－α在心室重塑中，能夠刺激心室肌成纖維細胞和間質細胞增生，促進心肌膠原酶、蛋白酶的合成，使心室肌組織異常增生、肥大、纖維化導致心肌細胞壞死和HF，并調節膠原酶和C－jun基因的表達，NF－α能夠誘導C－jun基因的持續激活，通過其與活化蛋白－1(AP－1)位點的結合導致MMPs基因激活，使心肌與其他細胞中的MMPs明膠分解活性增強〔12〕，有研究報道，β受體阻滯劑可通過減少心肌細胞TNF－α等細胞因子的表達而改善左室重塑和心功能〔13〕，但是，rhEPO能否通過調節TNF－α的表達改善心臟功能尚未見文獻報道。

關于EPO保護缺血心肌的機制，目前爭論較多，EPO心臟保護作用的機制尚不完全清楚。本實驗結果提示，rhEPO能夠很可能通過下調炎性因子TNF－α的表達來改善心臟功能，這個發現將為MI的藥物治療提供一定參考依據，

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7 馬 驥，鄭鳴之，俞月萍.促紅細胞生成素抑制心梗大鼠心肌核轉錄因子CHOP表達的研究〔J〕.中國藥學雜志，2011;46(1):24－7.

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R541.71

A

1005-9202(2015)09-2375-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.028

1 遼寧省人民醫院金秋醫院護理部

蔡長華(1958－)，男，主任醫師，主要從事心功能不全患者的藥物治療研究。

邢 軍(1976－)，男，碩士，主治醫師，主要從事心血管疾病的介入治療研究。

〔2014-03-13修回〕

(編輯 曹夢園)