成人特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血γδT細(xì)胞及IL-17、IL-23水平的變化和意義

楊國雷　張復(fù)華　凌奕文　牛國敏

成人特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血γδT細(xì)胞及IL-17、IL-23水平的變化和意義

楊國雷張復(fù)華凌奕文牛國敏

【摘要】目的 通過檢測ITP患者外周血γδT細(xì)胞、IL-17與IL-23水平的變化，進(jìn)一步探討ITP的發(fā)病機制，為ITP的防治新途徑提供理論依據(jù)。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血γδT細(xì)胞；酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測 IL-17、IL-23。實驗組分正常對照組和ITP組；ITP組分為治療前組與治療后組（有效組、無效組）；ITP組初始均予地塞米松10 mg/d，此后口服強的松維持并逐漸減量，總療程1個月。結(jié)果 正常對照組外周血γδT、IL-17、IL-23分別為（6.41±1.76）%，（43.04±6.10）pg/ml，（34.03± 3.64）pg/ml；ITP治療前組：γδT、IL-17、IL-23分別為（14.90±2.41）% ，（76.67±11.86）pg/ml，（63.06±12.08）pg/ml；治療有效組：γδT、IL-17、IL-23 分別為（7.19±1.29）%，（53.95±11.97）pg/ml，（37.12±3.89）pg/ml；治療無效組：（12.87±2.11）%，（62.51±10.11）pg/ml，（58.42±10.08）pg/ml。結(jié)論 ITP患者外周血γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平較正常人高，γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23參與了ITP的發(fā)生發(fā)展；ITP患者治療有效者γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平下降。

【關(guān)鍵詞】ITP；γδT細(xì)胞；白介素-17；白介素-23

作者單位：528200佛山，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院

Changes and Significance of Peripheral Blood γδT Cells and IL-17 and IL-23 Levels in Patients With Idiopathic Thrombocytopenic Purpura

YANG Guolei ZHANG Fuhua LING Yiwen NIU Guomin, Affiliated Nanhai Hospital of Southern Medical University, Foshan 528200, China

[Abstract]Objective To explore the pathogenesis of idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP), and provide theoretical basis for new pathways to the prevention and control of ITP, through testing γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patients. Methods γδT cells in peripheral blood was testing by flow cytometry. IL-17 and IL-23 in peripheral blood was testing by enzyme-linked immunosorbent assay. Experiment group was divided into normal control group and ITP patient group. ITP patient group was divided into pre-treatment group and

treatment group(effective and non-effective group). ITP patient group was initially given dexamethasone 10 mg/d, following oral prednisone(reduced gradually), total course lasting a month. Results γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of normal control group were(6.41±1.76)%,(43.04± 6.10)pg/ml,(34.03±3.64)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP pre-treatment group were(14.90±2.41)%,(76.67±11.86)pg/ml,(63.06±12.08)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP effective treatment group were(7.19±1.29)%,(53.95±11.97)pg/ml,(37.12±3.89)pg/ml, respectively. γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP non-effective treatment group were(12.87±2.11%)%,(62.51±10.11)pg/ml,(58.42±10.08)pg/ml. respectively. Conclusion The level of γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patient was higher than that in normal peoplem, therefore they play a part in the development of ITP. After effective treatment, the level of γδT cells, IL-17 and IL-23 in peripheral blood of ITP patient declined.

[Key words]ITP, γδT, IL-17, IL-23

特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是臨床最為常見的出血性疾病，研究證實T淋巴細(xì)胞異常在ITP發(fā)病中起重要作用。本研究通過檢測ITP患者外周血γδT細(xì)胞、IL-17與IL-23水平的變化，進(jìn)一步探討ITP的發(fā)病機制，為ITP的預(yù)后、治療提供新的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

對照組來自門診健康體檢者：18～60歲，男女不限，近期無感染、免疫性疾病病史；無使用免疫抑制劑藥物史。ITP組：2013年1月～2015年1月在我院住院治療的ITP患者27例，男12例，女15例， 年齡18～60歲，血小板＜30×109/L，伴臨床出血，診斷符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第三版）。

1.2研究分組

研究分組分為正常對照組與ITP組，ITP組分為治療前組與治療后組。所有患者初始均予地塞米松10 mg，靜滴，1次/日，后續(xù)口服強的松并逐漸減量；血小板極低伴出血嚴(yán)重者，聯(lián)合丙種球蛋白[0.4 g/（kg·d），ivdrip，3～5 d]，機采血小板及止血支持治療。治療時間均為1月，再次采血檢驗。療效標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第三版）。

1.3實驗方法

1.3.1流式細(xì)胞術(shù)外周血γδT細(xì)胞的檢測 （1）空腹，EDTA抗凝管采靜脈血2 ml；（2）取流式管2支，各加入樣本100 μl；（3）對照組加入IgG1-FITC，IgG2a-PE抗體，各10 μl；測試管加入CD3-PE，γδTCR-FITC抗體，各10 μl，震蕩搖勻，室溫下避光25～30 min；（4）各管加入2 ml FACS溶血素，震蕩搖勻，室溫下避光8～12 min；（5）震蕩搖勻，1 000 r/min，5 min，棄上清液；沉淀中加入2 ml磷酸鹽緩沖液（PBS液），震蕩搖勻，1 000 r/min，5 min，棄上清液；（6）沉淀中加入0.5 ml含1%多聚甲醛的PBS緩沖液，震蕩搖勻，2℃～8℃保存，24 h內(nèi)上機檢測；（7）以FS/SS，做點圖，設(shè)淋巴細(xì)胞門；再以F1/F2（CD3/ γδTCR）做點圖，畫出象限，以陰性管調(diào)節(jié)電壓、閾值；以陽性管調(diào)節(jié)補償，獲取細(xì)胞后，分析外周血CD3/γδTCR雙陽性細(xì)胞百分比。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測 IL17、IL23 （1）加樣：分別設(shè)空白孔與待測樣品孔；（2）溫育、洗滌；（3）加酶、溫育、洗滌；（4）顯色：每孔加入顯色劑，輕輕震蕩混勻，避光顯色15 min；（5）終止：每孔加終止液，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）；（6）測定：以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（x-±s）表示；采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ITP患者外周血γδT細(xì)胞水平

正常對照組外周血γδT為（6.41±1.76）% ；ITP治療前組：γδT為（14.90±2.41）%；治療有效組：γδT為（7.19±1.29）%；治療無效組：γδT為（12.87±2.11）%。

2.2ITP患者外周血IL-17、IL-23水平

正常對照組外周血IL-17、IL-23分別為（43.04±6.10）pg/ml、（34.03±3.64）pg/ml；ITP治療前組：L-17、IL-23分別為（76.67±11.86）pg/ml、（63.06±12.08）pg/ml；治療有效組：IL-17、IL-23 分別為（53.95±11.97）pg/ml、（37.12±3.89）pg/ml；治療無效組：L-17、IL-23分別為（62.51±10.11）pg/ml、（58.42±10.08）pg/ml。

3　討論

越來越多的研究證實T淋巴細(xì)胞異常在特發(fā)性血小板減少性紫癜發(fā)病中起重要作用。外周血成熟T淋巴細(xì)胞按其抗原識別受體（TCR）不同，分為αβT細(xì)胞與γδT細(xì)胞。αβT淋巴細(xì)胞異常在ITP發(fā)病中的作用研究較多且得到證實，主要表現(xiàn)在Th1/Th2細(xì)胞亞群平衡失調(diào)；細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的血小板破壞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg Cell）減少[1]等。γδT細(xì)胞能夠誘導(dǎo)初始αβT細(xì)胞的增殖、分化，參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。γδT細(xì)胞表面表達(dá)IL-23受體（IL-23R），與IL-23結(jié)合，產(chǎn)生大量IL-17，引起免疫炎癥反應(yīng)[2-3]。此外，γδT可通過表達(dá)IL-23R途徑，能夠抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的活性，增強免疫炎癥反應(yīng)[4]。總之，γδT細(xì)胞及IL-17、IL-23在自身免疫相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且關(guān)系密切。然而，關(guān)于γδT細(xì)胞及IL-17、IL-23在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的研究報告卻非常少見。Russell E. Ware RE等研究發(fā)現(xiàn)[5]，γδT在兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）部分患者中表達(dá)增多，且與血小板減少程度有關(guān)，提示γδT在ITP發(fā)病中起重要作用；而國內(nèi)尚未見有關(guān)γδT細(xì)胞在ITP發(fā)病中的作用的研究報告。馮越等[6]報告32例兒童ITP患者IL-17、IL-23水平較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Rocha AM等[7]發(fā)現(xiàn)慢性ITP患者較正常對照組，外周血中IL-17A升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義。然而，Ma DX等[8]發(fā)現(xiàn)慢性ITP患者組與健康對照組血漿中IL-17濃度無顯著差異。

我們進(jìn)行了18例正常對照組與27例ITP患者外周血γδT細(xì)胞、IL-17與IL-23水平的檢測，發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血γδT細(xì)

胞、IL-17、IL-23水平較正常人明顯升高；27例患者經(jīng)統(tǒng)一劑量激素治療1月，治療有效組17例，治療無效組10例，再次進(jìn)行外周血γδT細(xì)胞、IL-17與IL-23水平的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療有效組γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平細(xì)胞水平較治療前下降；而治療無效組γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平較治療前無明顯下降。因此提示γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23參與了特發(fā)性血小板減少性紫癜的發(fā)生發(fā)展，糖皮質(zhì)激素治療有效者γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平下降。由于本實驗時間有限，展望下一步可采用主要對T細(xì)胞功能抑制的環(huán)孢素進(jìn)一步研究，尤其針對糖皮質(zhì)激素治療無效患者，觀察環(huán)孢素對該類患者γδT細(xì)胞、IL-17、IL-23水平的影響，以及與療效的關(guān)系。

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doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.24.027

【文章編號】1674-9308（2015）24-0041-03

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

【中圖分類號】R593.2