DLC-1基因在晚期肺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

高湘湘　葛伯建　林蘭　劉益飛　金聰慧

DLC-1基因在晚期肺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

高湘湘葛伯建林蘭劉益飛金聰慧

目的 探討DLC-1基因在晚期肺癌組織中的表達(dá)水平及與肺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。方法 對(duì)72例肺癌組織標(biāo)本及癌旁組織進(jìn)行DLC-1基因擴(kuò)增檢測(cè)，然后對(duì)患者隨訪1年。根據(jù)不同組別患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存情況，分析DLC-1基因的表達(dá)狀況與預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果 72例肺癌標(biāo)本組織中有9例的DCL-1基因表達(dá)陽性（12.5%），與之相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中有50例DCL-1基因表達(dá)陽性（66.7%），兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.27，P＜0.001）。對(duì)72例肺癌患者隨訪1年后發(fā)現(xiàn)：DLC-1 基因的表達(dá)狀況與患者的組織學(xué)、組織分化、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)（χ2=18.67，P＜0.001），與患者的1年生存相關(guān)（χ2=6.81，P＜0.01）。結(jié)論 DLC-1基因在肺癌組織中表達(dá)缺失或者低表達(dá)，并與肺癌患者較差的臨床預(yù)后相關(guān)。

DLC-1基因晚期非小細(xì)胞肺癌；mRNA；臨床特征

原發(fā)性肺癌是世界范圍發(fā)病率和死亡率都很高的疾病之一［1］。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要病理類型，絕大多數(shù)NSCLC患者就診時(shí)已經(jīng)為晚期，沒有根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，內(nèi)科治療在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中占據(jù)重要地位［2-4］。目前，針對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性分子靶點(diǎn)抗腫瘤治療的相關(guān)研究和臨床應(yīng)用已成為了熱點(diǎn)。作者通過檢測(cè)DLC-1基因在未經(jīng)治療的晚期肺癌組織中的表達(dá)狀況，并與肺癌患者的預(yù)后進(jìn)行綜合分析，來探討DLC-1基因與肺癌發(fā)展的關(guān)系，探討其對(duì)于肺癌治療的預(yù)測(cè)價(jià)值和預(yù)后價(jià)值。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院2012年6月～2014年1月經(jīng)肺穿刺并經(jīng)由病理科確診的IIIB肺癌患者38例及IV期肺癌患者34例，其中男45例，女27例，年齡56～79歲，平均年齡（62.5±6.2）歲，均接受鉑類為主的全身化療。患者取材前未接受過放療、化療或靶向治療，肝、腎功能正常，排除孕婦、哺乳期婦女、精神疾病患者。每例肺癌標(biāo)本均有自身配對(duì)的癌旁正常組織作為對(duì)照。獲取標(biāo)本后立即置入液氮冷卻，再轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱長期保存。

1.2主要儀器

電泳儀購自Pharmacia Fine Chemicals公司，型號(hào)ECPS 3000/150；紫外分光光度計(jì)定量購自日本日立公司，型號(hào)U-2001；PCR擴(kuò)增儀購自德國Biometra公司，型號(hào)Tgradient；高速低溫離心機(jī)購自美國BECKMAN公司，型號(hào)AllegraTM RA 64R；凝膠圖像分析儀購自美國BIO-RAD公司，型號(hào)Gel Doc XR+。

1.3總RNA提取方法

總RNA的提取對(duì)晚期肺癌織組、癌旁組織分別提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。總RNA提取試劑盒R6834購自美國OMEGA公司，具體步驟參照說明書，提取的總RNA立即置于-70℃保存。

1.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)肺癌織組、癌旁織組分別取3 μg總RNA按照試劑盒反應(yīng)體系行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參照，DLC-1基因及β-actin 引物序列合成均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，DLC-1基因mRNA引物正義鏈：5'-GCTT GTGAT TGGCTACGG-3'反義鏈：5'-CCACCT CTT GCTGT CCCT-3'。β-actin mRNA引物（內(nèi)參）正義鏈：5'-CCCT GGACT TCGAGCAAGAGAT- 3'反義鏈：5'-GTT T TCT GC GCAAGT TAGG-3'。反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，94℃ 30s，溫度退火30 s，72℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶觀察在電泳條帶上出現(xiàn)276 bp為陽性即DLC-1 基因的表達(dá)。

1.5評(píng)價(jià)方法

隨訪通過電話或住院隨訪對(duì)所有72例患者進(jìn)行隨診，隨訪時(shí)間為肺癌確診后1年。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 14.0軟件計(jì)算數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DLC-1基因的表達(dá)狀況

肺癌標(biāo)本組織中的DCL-1基因的陽性表達(dá)率為12.5%，與之相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中DCL-1基因的陽性表達(dá)率為66.7%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.27，P＜0.001），見圖1。

2.2DLC-1基因的表達(dá)狀況與晚期肺癌預(yù)后的關(guān)系

對(duì)72例晚期肺癌患者隨訪1年，結(jié)合DLC-1 mRNA的表達(dá)狀態(tài)分析，可以看出DLC-1基因的表達(dá)缺失與患者的組織學(xué)、組織分化、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.001），與患者的1年生存率也相關(guān)（P＜0.01）。

2.3生存分析

72例患者在隨訪期間共有6例失訪，按統(tǒng)計(jì)學(xué)處理規(guī)則，失訪數(shù)據(jù)按存活病例計(jì)算。死亡病例51例，均死于腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展。Kaplan-Meier生存分析顯示，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.459，P=0.019），見圖2。

3　討論

DLC-1基因當(dāng)前被認(rèn)為是一個(gè)新的抑癌基因，既往有研究者發(fā)現(xiàn)它在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤組織中存在表達(dá)缺失現(xiàn)象［5］。我們的研究擬進(jìn)一步探索它在晚期肺癌中的表達(dá)狀況，以及對(duì)于臨床治療的預(yù)測(cè)價(jià)值和預(yù)后價(jià)值。在我們的前期研究中，已經(jīng)探索了DLC-1基因在早期、可手術(shù)肺癌中的表達(dá)情況。我們通過RT-PCR方法對(duì)可手術(shù)的早期肺癌患者，分別取肺癌織組、癌旁織組和良性病變組織進(jìn)行DLC-1基因擴(kuò)增檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DLC-1基因的表達(dá)缺失與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。肺癌組織中，DLC-1表達(dá)缺失的狀況與癌旁組織和良性病變差異明顯，而且DLC-1基因表達(dá)的缺失與否，與腫瘤的分期相關(guān)：對(duì)于Ⅱ期和Ⅲ期患者，DLC-1基因表達(dá)缺失的比例明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在此項(xiàng)研究中，我們關(guān)注DLC-1基因在晚期肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，以及與患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及生存的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于晚期肺癌，DLC-1基因在肺癌組織中明顯呈表達(dá)缺失的狀態(tài)，72例肺癌組織，只有9例表達(dá)陽性；與之相對(duì)應(yīng)的是癌旁組織50例表達(dá)陽性，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.27，P＜0.001）。將患者隨訪1年的數(shù)據(jù)與DLC-1基因的表達(dá)情況綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于未經(jīng)治療的晚期肺癌，DLC-1基因的表達(dá)缺失與差的預(yù)后相關(guān)。而且相對(duì)于DLC-1基因表達(dá)陽性的患者，DLC-1基因表達(dá)缺失患者更加容易發(fā)生復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，而且1年生存率也低于陽性組。這進(jìn)一步驗(yàn)證了DLC-1基因作為抑癌基因，在晚期肺癌的發(fā)展中起到了一定的作用［6］。

肺癌的遺傳學(xué)改變相關(guān)研究熱點(diǎn)，主要集中于兩個(gè)方面：第一，原癌基因表達(dá)、相關(guān)生長因子表達(dá)及其受體的研究［7］。第二，抑癌基因和其他生長調(diào)節(jié)基因功能喪失。這些基因的異常改變，除了與肺癌的發(fā)生有關(guān)外，還與其浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，間接或直接地影響到肺癌的預(yù)后。DLC-1定位于人類染色體8p21-22，這一區(qū)域在很多惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生缺失，如腸癌、肝癌、乳腺、鼻咽癌、前列腺癌等。Wong等［8］研究發(fā)現(xiàn)DLC-1基因表達(dá)產(chǎn)物為RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激活蛋白，與調(diào)控細(xì)胞增殖和黏附的信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系密切，主要通過下調(diào)Rho的活性而抑制腫瘤。也有研究者證實(shí)DLC-1可通過GTP酶活性抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。關(guān)于DLC-1基因在晚期肺癌中發(fā)揮抑制腫瘤的具體機(jī)制，我們還將進(jìn)一步進(jìn)行研究。

肺癌是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，“一刀切”式非選擇性人群的研究和治療逐漸被摒棄。接下來我們還將進(jìn)一步研究不同的治療方案與DLC-1基因表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)系，希望在不遠(yuǎn)的將來，我們可以應(yīng)用分子病理學(xué)來區(qū)分不同類型的腫瘤，對(duì)患者進(jìn)行真正意義上的個(gè)體化治療，這也會(huì)使越來越多的患者真正獲益。

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［2］劉霜莉，舒榕. RNAi技術(shù)沉默Survivin基因抑制肺癌細(xì)胞株H1299增殖并誘導(dǎo)其凋亡［J］. 內(nèi)科急危重癥雜志，2015，21（4）：308-311.

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［4］田紅霞，張緒超，王震，等. MassARRAY質(zhì)譜分析肺癌多基因突變方法的建立與應(yīng)用［J］. 中國腫瘤臨床，2015，42（17）：856-861.

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［6］林鋼，王準(zhǔn)，孫曉江，等. 可手術(shù)非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及其臨床意義［J］. 中國腫瘤臨床，2015，42（18）：921-925.

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［8］DeSantis CE，Lin CC，Mariotto AB，et al. Cancer treatment and survivorship statistics， 2014［J］. CA: a cancer journal for clinicians，2014，64（4）：252-271.

Expression of DLC-1 Gene in Advanced Lung Cancer and Its Correlation With Prognosis

GAO Xiangxiang GE Bojian LIN Lan LIU Yifei JIN Conghui， Department of Medical Oncology， Affiated Tumor Hospital of Nantong University，Nantong 226001， China

Objective To study the expression of DLC-1 gene in the late lung cancer tissue and its relationship with the clinical characteristics of the patients. Methods DLC-1 gene levels were detected in 72 cases of lung cancer and pericarcinomatous tissues. The patients were followed up for one year. We analyzed the correlation between the expression of DLC-1 gene and clinical prognosis of the patients according the metastasis， recurrence， and overall surial. Results DCL-1 gene expression was positive in 72 cases （12.5%） in 9 cases of lung cancer tissues， and 50 were positive for DCL-1 gene expression （66.7%）in the corresponding adjacent tissues， there was significant difference between them （χ2=48.27， P ＜ 0.001）， of 72 cases of lung cancer patients were followed up for 1 year later found that DLC-1 Gene Expression in patients with tissue， tissue differentiation， recurrence or metastasis associated （χ2=18.67， P＜ 0.001）， and with a 1 year survival （χ2=6.81， P＜0.01）. Conclusion The expression of DLC-1 gene in lung cancer tissue is low or low， and it is associated with poor clinical prognosis in patients with lung cancer.

DLC-1 gene advanced non small cell lung cancer， mRNA，Clinical characteristic

R734

A

1674-9308（2015）33-0045-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.33.030

226001 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

南通市應(yīng)用研究科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（BK2012069）通訊作者：葛伯建，E-mail：doctorge@126.com