高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關物質

張翠蘭

(涿州市醫院內分泌科，河北 涿州　072750)

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高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關物質

張翠蘭

(涿州市醫院內分泌科，河北 涿州072750)

摘要：目的建立高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關物質的方法。方法采用AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(pH=3.0)—乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為210 nm，進樣量為20 μL。結果高效液相色譜法測定有關物質的線性范圍均為0.5～10.0 mg·L-1，相關系數均大于0.999(n=6)。結論該方法簡單、精確，有關物質的分離度較好，可以作為那格列奈膠囊有關物質的測定方法。

關鍵詞：那格列奈膠囊；有關物質；高效液相色譜法

那格列奈膠囊的藥用活性成分為那格列奈，是一種臨床上應用于治療2型糖尿病的可以口服的處方藥[1-2]。那格列奈，其英文名為Nateglinide，CAS號為105816-04-4，化學名為N-(反式-4-異丙基環已基-1-甲酰基)-D-苯丙氨酸，其主要是通過與胰島B細胞的磺酰脲受體結合，阻滯胰島細胞ATP敏感鉀通道開放，細胞膜去極化，從而引起鈣通道開放，促進胰島素的分泌，是一種新型的餐時血糖調節劑[3-4]。那格列奈膠囊能夠有效控制餐后的血糖水平，具有起效快、作用時間短，心血管副作用和低血糖發生率低等優點，具有廣闊市場前景。通過研究那格列奈的合成工藝[5-7]，查閱美國藥典[8]項下那格列奈知那格列奈主要存在以下4種有關物質，即：trans-4-Isopropylcyclohexylcarboxylic acid(有關物質A)、N-(trans-4-Ethylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine(有關物質B)、N-(trans-4-Isopropylclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-D-phenylalanine(有關物質C)、N-(trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-ethyl ester(有關物質D)，本實驗建立了高效液相色譜法測定那格列奈膠囊中有關物質的方法，為控制那格列奈膠囊的質量提供了參考。

1儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity LC色譜儀(Agilent technologies);色譜柱為AlltimaTM C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；PHS-3C酸度計(天津市賽得利實驗分析儀器有限公司)；BT25S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，精密度為十萬分之一)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；那格列奈對照品(購于TLC公司，純度99.9%，批號：tlc1403008)；有關物質A(購于TLC公司，純度99.3%,批號：tlc1407034)；有關物質B(購于TLC公司，純度99.6%,批號：tlc1405028)；有關物質C(購于TLC公司，純度99.2%,批號：tlc1409107)；有關物質D(購于TLC公司，純度99.6%,批號：tlc1404064)；那格列奈膠囊(自制，批號：150109、150203、150402)；參比那格列奈膠囊(海南海靈化學制藥有限公司，規格為每片30 mg，批號:141207)；乙腈為色譜純；實驗用水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：20 μL；柱溫：30℃。流動相A：0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(含1%磷酸)，用三乙胺調節pH=3.0;流動相B：乙腈按照表1進行梯度洗脫。

表1　乙腈洗脫梯度

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液制備取那格列奈膠囊，除去膠囊外殼，將膠囊內填充物研細，取適量細粉(約相當于那格列奈25 mg)，精密稱量，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于100 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為那格列奈膠囊供試品溶液。

2.2.2輔料溶液的制備取那格列奈膠囊中的各個輔料，按照制劑處方工藝中的輔料比例進行稱取，充分混合，精密稱量125 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為那格列奈膠囊輔料溶液。

2.2.3有關物質對照品溶液的制備分別精密稱量有關物質A、B、C、D對照品各10 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得到有關物質A、B、C、D的乙腈儲備液。精密量取有關物質各儲備液2.0 mL，分別置于100 mL的容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為有關物質A、B、C、D對照品溶液，溶液濃度均為2.0 mg·L-1。

2.2.4混合溶液的制備精密量取“2.2.1”項下制備的供試品溶液和“2.2.3”項下制備的各有關物質的對照品溶液，依次置于同一個50 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為那格列奈和有關物質A、B、C、D的混合溶液。

2.3系統適應性實驗及專屬性實驗 按“2.1”項所述的色譜條件，依次準確量流動相、輔料溶液、混合溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。那格列奈及有關物質A、B、C、D的保留時間如圖1～5中所示，那格列奈峰峰形良好，主峰與各雜質峰之間的分離度均大于1.5，各峰的理論塔板數均大于5 000，對稱因子均為1.0左右，對稱性良好；空白溶劑、輔料略有吸收，空白溶劑色譜圖中有微小的溶劑峰、梯度峰，與那格列奈及各有關物質峰均不重合，可扣除，輔料色譜圖中出峰時間很早，可扣除，因而不會影響測定結果準確性，此方法專屬性較好。

2.4精密度實驗取“2.2.3”項下的有關物質A、B、C、D的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，連續操作進樣6次。有關物質A、B、C、D的峰面積值RSD分別為0.75%、0.82%、0.93%、0.64%，結果說明儀器精密度良好。

2.5線性關系實驗取“2.2.3”項所述的有關物質 A 的乙腈儲備液適量置于容量瓶中，加入流動相稀釋配成有關物質 A 濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1系列溶液，按“2.1”項所述的色譜條件，分別精密量取20 μL依次注入色譜儀，記錄色譜圖。

以有關物質的進樣濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得到有關物質A回歸方程為A=45.99C- 0.087 2，R= 0.999 58。

依同樣方法得到有關物質B的回歸方程為A=33.55C-0.40，R=0.999 46;

有關物質C的回歸方程為A=38.63C+0.36，R= 0.999 16;

有關物質D的回歸方程為A=45.17C-0.87，R= 0.999 53;

以上結果表明，有關物質A、B、C、D在濃度范圍內有關物質的濃度與峰面積均呈良好的線性關系，有關物質 A、B、C、D濃度的線性均為0.5～10.0 mg·L-1。

2.6定量限與檢測限實驗量取“2.2.3”項下取有關物質A、B、C、D線性范圍內的最低濃度逐漸稀釋，進樣，記錄色譜圖，取信噪比(S/N)為 10 的濃度為定量限濃度，信噪比(S/N)為 3 的濃度為檢測限濃度。測得有關物質的結果表2所示。

表2　定量限與檢測限實驗結果

2.7穩定性實驗取“2.2.3”項下的有關物質A、B、C、D的對照品溶液，濾過，精密量取續濾液各20 μL 分別于0、0.5、1.0、2.0 、4.0 、12 h 時進樣，記錄色譜圖，測得峰面積的RSD值分別為0.9%、1.1%、1.4%、0.8%。結果表明有關物質A、B、C、D的溶液在12 h 內均穩定。

2.8加樣回收率實驗取那格列奈膠囊，研細，取細粉適量，精密稱定，按“2.2.1”項下的供試品溶液配制方法，配成濃度為150 mg·L-1的溶液，精密量取供試品溶液和有關物質的對照品溶液適量，分別置于10 mL容 量瓶中，再向容量瓶中加入適量的有關物質A，用流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成有關物質A的試驗供試品溶液，濾過，精密量取續濾液20 μL 分別注入色譜儀，記錄色譜圖。相應試驗平行制備3份，并進行相應的檢測。

依同樣方法制備有關物質B、C、D的供試品溶液，并進行檢測。按外標法以峰面積計算回收率，加樣回收率實驗結果見表3所示。由結果可知，在此色譜條件下各有關物質的回收率良好。

表3　加樣回收率實驗結果

2.9那格列奈膠囊有關物質的檢測取自制那格列奈膠囊三批和購買的參比制劑，按“2.2.1”項下所述的供試品溶液制備方法，依次配制各批次供試品溶液和參比制劑對照品溶液。按“2.1”項所述的色譜條件，分別精密量取20 μL，依次注入色譜儀，記錄色譜圖，實驗測定結果如表4所示。實驗結果表明，自制三批那格列奈膠囊有關物質均小于0.1%，均未超過限度要求，與參比制劑有關物質大體上一致或更優，符合中國藥典及申報的要求。

表4　那格列奈膠囊有關物質檢測結果/%

3討論

3.1流動相pH值的選擇查閱相關文獻資料中相似的檢測方法[9-12]，選用流動相pH=1.0進行等度洗脫，結果顯示理論塔板數雖較高，但有關物質C、D的色譜峰拖尾嚴重，峰形不好，且有關物質D與主峰的分離度較小，不能較好的分離。本實驗考察了流動相A調節為不同的pH值對色譜峰的影響，發現調節至pH=3.0時，峰形、分離度、塔板數均符合要求且比其他條件更優，故最終選擇此色譜條件。

3.2檢測波長的選擇取那格列奈對照品，按“2.2. 3”項所述方法配制那格列奈對照品溶液，采用TU-1900紫外—可見分光光度計，于200～400 nm進行掃描，結果如圖6所示，那格列奈在210 nm、258 nm處均有較大吸收；將有關物質A、B、C、D對照品溶液于200～400 nm進行掃描 ，結果如圖7所示，有關物質的最大吸收均在210 nm處，因此本實驗建立的色譜條件選擇210 nm作為檢測波長。

綜上所述，本實驗所建立的高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關物質的方法，操作簡便，專屬性、適用性較強，分離度很好，適用于那格列奈膠囊中有關物質的控制檢測，同時為那格列奈膠囊質量體系的建立提供了參考，為那格列奈仿制藥的申請提供了依據。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.017

(收稿日期：2015-04-18，修回日期：2015-06-07)

Determination of the related substances in Nateglinide capsules by HPLC

ZHANG Cui-lan

(Department of Endocrinology, Zhuozhou Hospital,Zhuozhou072750,China)

Abstract:Objective To control the related substances in Nateglinide capsules by HPLC. Methods Seperation was performed on an AlltimaTMC18column (250 mm×4.6 mm，5 μm). The mobile phase was a mixture of ammonium dihydrogen phosphate (pH=3.0) - acetonitrile with flow rate at 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30℃. The detection wavelength was 210 nm and injection volume was 20 μL. Results There was a good linearity over the range of 0.5～10.0 mg·L-1with a correlation coefficient greater than 0.999(n=6). Conclusions This method is easy to operate, accurate and highly sensitive , which can be applied to control the related substances in Nateglinide capsules.

Key words:Nateglinide capsules;related substance;HPLC