三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法驗證

施　敏,管　敏,周琴妹

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京　 210029)

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三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法驗證

施敏,管敏,周琴妹

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029)

摘要:目的 建立皮炎洗劑、黃芩油膏及燙傷藥水這三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法。方法 按照2010年版《中國藥典》的規定測定三種制劑對5種規定試驗菌株的回收率，并對其控制菌檢查方法進行驗證。結果皮炎洗劑采用薄膜過濾法，黃芩油膏采用培養基稀釋法，燙傷藥水采用預濾過和培養基稀釋法聯用，5種菌回收率均可達到70%以上，控制菌檢查采用常規方法和培養基稀釋法。結論該文建立了皮炎洗劑、黃芩油膏及燙傷藥水這三種不同劑型的、具有抑菌成分的微生物限度檢查方法。

關鍵詞：薄膜過濾法；培養基稀釋法；外用制劑；微生物限度

皮炎洗劑、黃芩油膏和燙傷藥水均為我院醫療機構制劑，在臨床被廣泛應用。該三種制劑為不同劑型的外用制劑，都含有抑菌成分，本文按照2010年版《中國藥典》一部[1]的要求，采用合適的方法，如培養基稀釋法，薄膜過濾法，預濾過法或幾種方法聯用，消除制劑的抑菌作用后再進行檢驗，以期建立更具科學性和合理性的微生物限度檢查方法，從而保證檢驗結果的準確性。

1試驗材料

供試品：皮炎洗劑、黃芩油膏、燙傷藥水均由我院制劑部生產，其處方組成、批號等信息詳見表1。

表1　三種制劑處方組成及批號信息表

試驗菌株：大腸埃希菌[CMCC(B) 44 102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10 104]、白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉[CMCC(F) 98 003]，以上由江蘇省藥檢所提供, 傳代次數均為第4代。

培養基：營養瓊脂培養基(批號：131224)、營養肉湯培養基(批號：070313)、改良馬丁瓊脂培養基(批號：050407)、改良馬丁培養基(批號：1110203)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：1401132)、膽鹽乳糖培養基(批號：1401072)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號：150513)，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號：100129),以上培養基均購自北京三藥科技開發公司。

稀釋液：pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液(批號：1306192，北京三藥科技開發公司)、0.9%無菌氯化鈉溶液(本實驗室配制)。

儀器：DNP-9082電熱恒溫培養箱(上海申賢儀器設備廠)，MJ-100B霉菌培養箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)，YX-280 D-TT手提式壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫療設備有限公司)，100級潔凈工作臺(AIR TECH ,蘇州安泰空氣技術有限公司)。

2試驗方法

2.1供試液的制備皮炎洗劑：吸取本品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液。

黃芩油膏：取樣品5 g于無菌研缽中，加入溶化的(溫度不超過45℃)5 g司盤80，3 g單硬脂酸甘油酯，10 g聚山梨酯80，慢慢加入45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，邊加邊研磨，使供試品充分乳化，作為1∶20的供試液。

燙傷藥水：吸取本品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液，采用脫脂棉對該供試液進行預過濾[2]，去除沉淀，濾液備用。

2.2菌液制備[1]接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，于30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23～28℃培養24～48 h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至相應濃度制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中, 培養5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的孢子懸液。

2.3細菌、霉菌及酵母菌計數驗證

2.3.1試驗組常規方法：上述供試液1 mL及試驗用菌的各種菌液1 mL，立即傾注15～20 mL溫度不超過45℃營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻，凝固，于相應溫度條件下倒置培養，計數。

培養基稀釋法：上述供試液 1 mL分別加至多個平皿中，加入試驗用菌的各種菌液1 mL。

薄膜過濾法：取供試品溶液1 mL，用薄膜過濾，以pH=7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液為沖洗液，在最后一次沖洗液中加入菌懸液1 mL，濾干后取出濾膜，菌面朝上貼于已制備好的相應瓊脂平板上，按菌落計數方法測定其菌落數，作為試驗組。

2.3.2菌液組不加供試液，同試驗組方法操作,分別測定各試驗菌的菌數。

2.3.3供試品對照組不加菌液，同試驗組方法操作,測定供試品的本底菌數。

2.3.4回收率計算分別計算5種試驗菌株的回收率。

2.4.1金黃色葡萄球菌試驗組：取相應的供試液10 mL及1 mL金黃色葡萄球菌(含菌數為10～100 cfu)，加入100 mL營養肉湯培養基中，經35～37℃培養24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養基進行分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

空白對照組：取相應的供試液10 mL，加入100 mL營養肉湯培養基中，經35～37℃培養24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養基進行分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

陰性組：1 mL大腸埃希菌(含菌數為10～100 cfu)，加入100 mL營養肉湯培養基中，經35～37℃培養48 h，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養基進行分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

2.4.2銅綠假單胞菌 試驗組：取相應的供試液10 mL及1 mL銅綠假單胞菌液(含菌數為10～100 cfu)，加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，振搖均勻，經35～37℃培養24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

空白對照組：取相應的供試液10 mL，加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，振搖均勻，經35～37℃培養24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

陰性組： 1 mL金黃色葡萄球菌(含菌數為10～100 cfu)，加入100 mL營養肉湯培養基中，經35～37℃培養24 h，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基分離培養，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

3試驗結果

3.1細菌、霉菌及酵母菌計數

3.1.1培養基稀釋法3種制劑先采用常規方法驗證，回收率達不到要求，故采用培養基稀釋法，5株試驗菌的回收率見表2。由表2可知，黃芩油膏采用培養基稀釋法驗證(每皿0.5 mL)，5種菌的回收率均大于70%，其抑菌作用基本被消除，可采用培養基稀釋法檢查細菌、真菌及酵母菌計數。燙傷藥水的溶劑是80%的乙醇，配成1∶10的供試液之后，兒茶素、冰片等水不溶性成分析出，析出的沉淀一方面具有較強抑菌作用[3]，另一方面影響平皿中菌落的計數，故先采用脫脂棉對供試液進行預過濾[2]，去除沉淀，濾液再采用培養基稀釋法驗證，回收率大于70%。

表2　培養基稀釋法回收率/%

3.1.2薄膜過濾法皮炎洗劑中含大黃、苦參、黃芩等藥材，抑菌活性較強[4-8]，采用培養基稀釋法大腸埃希菌等多株菌的回收率均低于70%，故采用薄膜過濾法，用100 mL pH=7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗，抑菌活性基本被消除，5株菌回收率達到70%以上，該法可作為皮炎洗劑的微生物限度檢查的方法。

3.2控制菌驗證黃芩油膏和燙傷藥水采用常規法，皮炎洗劑采用培養基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗組均可檢出，陰性對照和空白對照未檢出，滿足要求，結果見表3。

表3　控制菌驗證結果

注：表中的培養基稀釋法使用的培養基為 200 mL。

4討論

皮炎洗劑由大黃、苦參、黃芩等藥材水煎煮濃縮而得，其中大黃素、苦參堿、黃芩苷均具有抗菌作用，皮炎洗劑的抑菌活性較強，采用常規法和培養基稀釋法回收率達不到要求，采用薄膜過濾法，用100 mL pH=7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗即可基本消除其抑菌作用，回收率大于70%。

黃芩油膏以凡士林為基質，制備供試液時，振搖、攪拌都不能使基質分散均勻，影響菌落計數，采用研磨法，邊加入表面活性劑邊研磨，至分散均勻。以羊毛脂、凡士林等為主要基質的油膏類制劑應優先選擇常規法和培養基稀釋法，而盡量避免使用薄膜過濾法，因為油脂性基質即使乳化后仍很難過膜，濾速緩慢，且很容易堵塞濾膜。

燙傷藥水為黃芩、兒茶、冰片等藥材的80%乙醇浸出液，抑菌活性較強，制成1∶10的供試液后，溶劑組成改變，兒茶、冰片等水不溶性成分析出，析出的沉淀一方面有較強抑菌作用，另一方面也影響平皿中菌落的計數。采用500 r·min-1低速離心5 min，仍有一部分沉淀浮于液面，故考慮用預過濾法進行粗濾去除沉淀，苑思坤等[2]的研究表明，用濾紙過濾，過濾后菌液濃度大幅降低，降低樣品中微生物檢出的幾率，不適宜用作樣品前處理的過濾介質；用紗布和脫脂棉為介質，過濾前后菌液的濃度基本保持一致，但紗布對微小懸浮物的濾除作用較差，故本實驗以脫脂棉為介質進行預過濾，而后濾液用培養基稀釋法進行檢查，5株菌的回收率均滿足要求。

皮炎洗劑、黃芩油膏和燙傷藥水分別為水提取制劑、醇浸出制劑和軟膏劑，基本涵蓋了中藥外用制劑的劑型，本試驗選取這三種具有代表性的外用制劑進行研究，其結果為今后具有抑菌活性的外用制劑的微生物限度檢查方法的建立提供了參考依據。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[2]苑思坤,李玉芝,王紅云.微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預處理方法探討[J].中國藥業,2010,19(18):42-43.

[3]周琴妹,吳旭彤.不同提取工藝的燙傷藥水抑菌試驗[J].中成藥,1994,17(3):20.

[4]田代華.實用中藥詞典[M].北京:人民衛生出版社,2002:93,1695.

[5]余傳隆,黃泰康，丁志遵,等.中藥辭海(第一卷)[M].北京:中國醫藥科技出版社,1993:326.

[6]宋立人,洪詢.現代中藥學大辭典[M].北京人民衛生出版社,2001:118,1865.

[7]陳展,凌曉云.痔瘺洗液微生物限度檢查方法的建立[J].安徽醫藥,2014,18(6)：1047-1050.

[8]施高翔,邵菁,汪天明,等.黃芩及其有效成分抗菌作用新進展[J].中國中藥雜志，2014,39(19):3713-3718.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.018

基金項目：江蘇省中醫院院級課題(No Y13043)

通信作者：周琴妹，女，主任中藥師，研究方向：藥品檢驗及新藥研發，E-mail：zhoumeizi0917@163.com

(收稿日期：2015-06-12，修稿日期：2015-08-11)

Methodological validation of microbial limit test in three kinds of
external preparations with antibacterial ingredients

SHI Min, GUAN Min, ZHOU Qin-mei

(AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210029,China)

Abstract：Objective To establish the methods of microbial limit test for three kinds of external preparations with antibacterial ingredients, such as PiYan lotion, HuangQin ointment and TangShang lotion. Methods According to Chinese Pharmacopoeia 2010, the recovery rates of these five stipulated microorganisms respectively treated by three preparations were detected. And the method of checking control bacteria were also validated. Results Membrane filtration method was proved to be applicable for PiYan lotion. Culture medium diluting method was proper for HuangQin ointment. And the methods combining medium diluting wih pre-filtration were adopted to TangShang lotion. The recovery rate of these five stipulated microorganisms reached 70% by appropriate methods. Routine method and culture medium diluting method were used for validation of the control bacteria test. Conclusion The methods of microbial limit test for these three different kinds of external preparations were established.

Key words:membrane filtration method;culture medium diluting method;external preparations;microbial limit test