人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理學(xué)和病原學(xué)特點(diǎn)

劉相波

禽流感病毒屬于甲型流感病毒[1]。人感染禽流感是由禽流感病毒引起的人類(lèi)疾病，根據(jù)禽流感病毒對(duì)雞和火雞的致病性不同，可將其分為低/非致病性、中、高三級(jí)[2]。由于禽流感病毒的血凝素結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，一般感染禽類(lèi)，在病毒復(fù)制過(guò)程中，出現(xiàn)基因重配，導(dǎo)致病毒結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，獲得感染人的能力，最終導(dǎo)致人感染禽流感疾病的發(fā)生[3]。近年來(lái)，禽流感不僅造成了人類(lèi)的傷亡，同時(shí)還對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重創(chuàng)[4]。近年來(lái)先后在朝鮮、越南、泰國(guó)、韓國(guó)、日本、中國(guó)等10多個(gè)亞洲國(guó)家爆發(fā)H5N1高致病性禽流感病毒，引起全球的高度關(guān)注[5]。此次研究對(duì)在2008年1月-2014年1月中國(guó)內(nèi)地人禽流感患者25例進(jìn)行研究，對(duì)其病理組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及病因?qū)W特點(diǎn)進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月-2014年1月中國(guó)內(nèi)地人禽流感患者25例作為研究對(duì)象，其中男16例，女9例，年齡22~86歲，25例患者均符合《人感染禽流感診斷方案》中的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者流行病學(xué)接觸史、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，可作出人感染H5N1禽流感診斷。流行病學(xué)史不詳?shù)幕颊撸鶕?jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出禽流感病毒，或禽流感病毒核酸檢測(cè)為陽(yáng)性，或動(dòng)態(tài)檢測(cè)雙份血清禽流感病毒特異性抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或呈4倍或以上升高[6]。

1.2 方法

1.2.1 胸腔局部解剖 對(duì)已死亡的1例患者進(jìn)行胸腔局部解剖，摘除患者氣管、雙肺及心臟。

1.2.2 病理組織學(xué)制片與觀察 使用4%甲醛對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定，使用石蠟包埋，然后連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)病理學(xué)組織進(jìn)行觀察。

1.2.3 組織化學(xué)染色 Macchiavello病毒包含體染色和網(wǎng)織纖維染色。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 采用單克隆抗體CK、CD68、CD20、CD8、CD4、CD3、S-100，EnVisionTM二步法染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察。

1.2.5 電鏡制片與觀察 使用2.5%預(yù)冷戊二醛對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行固定，1%鋨酸后固定，使用樹(shù)脂包埋，然后將其超薄切片，使用乙酸鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，然后使用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定、全基因組序列測(cè)定及動(dòng)物致病性觀察 細(xì)胞培養(yǎng)特性和培養(yǎng)細(xì)胞電鏡觀察；RT-PCR測(cè)定與部分基因序列分析；血清學(xué)試驗(yàn)；全基因組序列測(cè)定和分析比較；新分離禽流感病毒動(dòng)物致病性觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 對(duì)行胸部局部解剖的患者觀察發(fā)現(xiàn)，該名患者左側(cè)胸腔內(nèi)有黃色渾濁液體約400 mL，其左側(cè)胸腔內(nèi)有少量淡黃色液體，該名患者壁胸膜外觀呈現(xiàn)淡紅色。氣管黏膜充血，并且氣管腔內(nèi)有少量淡紅色分泌物。患者左肺上下葉外觀呈現(xiàn)出廣泛性實(shí)變狀，呈暗紅色，其切面有粉紅色泡沫狀液體流出；左肺呈現(xiàn)出淡粉紅色，散在斑片狀暗紅色區(qū)。心包內(nèi)存在少量的淡黃色液體。患者心臟外觀正常。

2.2 光鏡檢查

2.2.1 肺臟 左肺臟主要表現(xiàn)為廣泛性肺實(shí)變，顯著的肺水腫和肺出血及壞死。急性彌漫性肺泡損傷表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞增生，核增大，染色質(zhì)濃聚，部分肺泡上皮細(xì)胞可以看見(jiàn)核異型性及核分裂象。患者肺泡腔內(nèi)有大量的蛋白性滲出液，大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞，少量的中性粒細(xì)胞及變性壞死脫落的肺泡上皮細(xì)胞以及多核或合體樣肺泡細(xì)胞，并且伴有明顯的透明膜形成；肺泡隔沒(méi)有明顯的增寬，有部分的小血管壁亦呈現(xiàn)纖維素性壞死，并且有少量的血栓形成。有部分區(qū)域的肺泡隔已經(jīng)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的損毀及壞死，融合成片，并且伴有大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。左肺病變較重，又肺病變較輕，肺組織內(nèi)出血、充血呈灶狀或片狀分部。肺泡腔內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞及少量的水腫液、中性粒細(xì)胞等改變，有透明膜形成。支氣管：黏膜中可以看見(jiàn)有淋巴細(xì)胞核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；部分小支氣管出現(xiàn)壞死，并且充滿了炎性滲出物。

2.2.2 心臟 心包小血管充血。心肌間質(zhì)水腫，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 免疫組織化學(xué)

2.3.1 肺臟 增生和脫落的肺泡上皮細(xì)胞及肺泡腔內(nèi)的合體和多核細(xì)胞均呈現(xiàn)CK陽(yáng)性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)CD68陽(yáng)性染色；只有少量的淋巴細(xì)胞CD3為陽(yáng)性，標(biāo)記B細(xì)胞的抗體CD79a及CD20均呈現(xiàn)陰性。SARS冠狀病毒S蛋白單克隆抗體染色呈陰性。

2.3.2 心臟 心肌間質(zhì)可以看見(jiàn)CD68陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且可看見(jiàn)有少量的CD3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 組織化學(xué)染色 （1）病毒包涵體染色：少量肺泡上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在嗜酸性染色球形顆粒。（2）網(wǎng)織纖維染色：患者肺部壞死區(qū)域內(nèi)肺泡壁網(wǎng)織纖維出現(xiàn)斷裂，崩解消失。

2.5 電鏡檢查 Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮存在明顯的細(xì)胞腫脹，并且細(xì)胞表面微絨毛減少，肺泡表面活性物質(zhì)膜消失，并且能夠觀察到細(xì)胞凋亡和壞死。Ⅱ型肺泡細(xì)胞核體積增大，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，能夠看見(jiàn)線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張。胞質(zhì)內(nèi)板層小體及早期病例相比數(shù)量增加。肺泡間隔內(nèi)血管內(nèi)皮紅細(xì)胞出現(xiàn)腫脹及空泡變性，肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)可看見(jiàn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和脫落的上皮細(xì)胞。在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞可以看到A型流行性感冒病毒樣顆粒，多數(shù)呈現(xiàn)出球形，有囊膜，大小約為80~120 nm，高電子密度核心居中的C型病毒顆粒數(shù)量較多，低電子密度核心的A型病毒顆粒數(shù)量較少。

2.6 病原體分離培養(yǎng)鑒定

2.6.1 病原體的分離培養(yǎng) 將血漿標(biāo)本接種Vero細(xì)胞16 h，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)病變，24 h后，CPE達(dá)到4+。經(jīng)0.2 μm孔徑的濾膜過(guò)濾后分別接種Vero細(xì)胞，出現(xiàn)CPE，與未經(jīng)過(guò)過(guò)濾的樣品無(wú)差別。除Vero細(xì)胞外，接種MDCK細(xì)胞，在MDCK細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)病變時(shí)間相對(duì)于Vero細(xì)胞較早。2.6.2 培養(yǎng)細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察 在細(xì)胞外能夠看到大量的病毒顆粒，并且有明顯的突起，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量的病毒。

2.6.3 RT-PCR測(cè)定 RT-PCR測(cè)定與部分基因序列分析均擴(kuò)增出A型流感病毒的部分M和HA基因片段。擴(kuò)增測(cè)序的M基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為96%。HA基因片段核苷酸序列與禽流感病毒的同源性為97%。

2.6.4 血清學(xué)試驗(yàn) 抗禽流感病毒特異血清H5N1、H9N1、N7N7特異血清。采用酶標(biāo)抗體染色法、間接免疫熒光染色、血凝抑制試驗(yàn)。使用雞抗禽流感病毒H5、H7、H9特異抗體進(jìn)行酶標(biāo)染色，然后分離病毒與雞抗禽流感病毒H5N1亞型特異抗體均呈現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)。免疫酶標(biāo)染色、血凝抑制試驗(yàn)均與H5N1亞型特異抗體呈現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。與SARS的特異抗體的反應(yīng)均呈現(xiàn)出陰性。

3 討論

人禽流行性感冒是由A型禽流感病毒的某些亞型毒株所造成的患者出現(xiàn)急性呼吸道傳染病，患者病死率較高，并且尚無(wú)有效的治療[7-8]。目前對(duì)有關(guān)人禽流感病原學(xué)、流行病學(xué)及其檢測(cè)的研究已經(jīng)有了進(jìn)展，但關(guān)于人禽流感的發(fā)生及發(fā)展的病理過(guò)程及臨床特點(diǎn)還沒(méi)有定論，需要進(jìn)一步的探索[9-10]。

此次研究使用電鏡、光鏡、免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)方法對(duì)25例患者臨床表現(xiàn)為多器官衰竭和急性呼吸窘迫的高致病性禽流感病毒H5N1亞型感染病例進(jìn)行觀察和研究，從而研究人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理學(xué)和病原學(xué)特點(diǎn)。

人感染禽流感病毒后，病毒在體內(nèi)的潛伏期約為1周，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱>39 ℃、氣促、呼吸困難、呼吸窘迫等；部分患者會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心等表現(xiàn)；癥狀較為嚴(yán)重的患者肺部病變發(fā)展較為快速，出現(xiàn)大片實(shí)變陰影，呈重癥急性肺炎改變，可能會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫、胸腔積液、多器官功能衰竭、肺出血等癥狀，患者病死率較高[11-12]。

綜上所述，高致病性A型禽流感病毒會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重急性病毒性肺炎，肺水腫、肺實(shí)變、明顯的出血性壞死性炎癥等病理改變?yōu)槠渲饕卣鳌ｋ婄R檢查可見(jiàn)A型禽流感病毒樣顆粒。研究人禽流行性感冒的病原學(xué)和病理學(xué)特點(diǎn)，為將來(lái)的人禽流感臨床診斷和治療方案提供了理論基礎(chǔ)和病理學(xué)基礎(chǔ)。

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