磁性納米多孔復合材料的致突變試驗研究

黃義鴻 朱偉民 王大平

·短篇論著·

磁性納米多孔復合材料的致突變試驗研究

黃義鴻 朱偉民 王大平

目的 從遺傳毒理學方面了解并評價磁性納米多孔復合(Nano-HA/PLLA/Fe2O3)材料的生物相容性, 從而為其在移植肌腱固定的臨床運用提供依據。方法 用Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料制備混懸液, 進行Ames致突變試驗, 以檢測其對鼠傷寒沙門菌的致突變比值(實驗組回變菌落數/陰性對照組回變菌落數)。結果 4個菌株在各個受試濃度待測液在加S9與不加S9的情況下, 致突變比值即實驗組回變菌落數與陰性對照組回變菌落數的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而陽性對照組致突變比值則均>2.0。結論 Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料不引起鼠傷寒沙門菌的回復突變數增加, 說明此材料無致基因突變性。

磁性納米多孔復合材料；致突變試驗

本研究通過低溫快速成型儀將Nano-HA、PLLA、Fe2O3這三種材料復合制備得到Nano-HA/PLLA/Fe2O3支架材料,并參照國內外對生物材料評價方面的有關標準, 擬通過Ames試驗從遺傳毒理性方面來評價此Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料的生物相容性, 從而為其運用于前交叉韌帶重建術中移植肌腱界面固定的臨床應用提供安全性依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗所用的Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料由深圳市第二人民醫院組織工程重點實驗室與中國科學院深圳先進技術研究院聯合研制, 立方體(25 mm× 25 mm×25 mm)。Nano-HA/PLLA/Fe2O3材料先用紫外線照射30 min, 經磷酸鹽緩沖液(PBS液)浸泡、清洗, 75%乙醇浸泡消毒后干燥備用。

1.2 實驗方法 取Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料, 按重量比以2.5%羥甲基纖維素鈉溶液配成5 mg/ml, 0.5 mg/ml及0.01 mg/ml三種不同濃度的混懸液受試。菌種采用由美國Ames實驗室提供并由湖南省疾病控制中心繁殖保存的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型菌株(TA-97、TA-98、TA-100和TA-102), 經性狀鑒定合格后進行實驗。由于Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料是用于人體內植入的, 植入人體后肝細胞微粒體酶系(S9)就有可能誘變HA(假如HA有誘變作用), 而細胞體內無此酶, 為了使實驗條件更接近體內環境, 將培養板分為活化實驗組(加S9溶液)和非活化實驗組(不加S9溶液)。大鼠肝臟微粒體酶系(S9)由多氨聯苯誘導, 制成肝勻漿后-80℃冰箱內保存,使用時用2-氨基芴測定其活力。實驗用柔毛霉素(濃度為25 μg/0.1 ml)作為菌株培養時的直接致突變活性指示(不加S9), 2-氨基芴(50 μg/0.1 ml)作為菌株的間接致突變活性指示(加S9)；以疊氮化鈉(5 μg/0.1 ml)作為陽性對照, 以同樣體積生理鹽水作為陰性對照。每個菌種的各個劑量組均各設3個平行皿。

通過平板滲入法將不同濃度組混懸液與菌株在最低營養板上混合培養, 經37℃培養48 h后, 分別進行觀察回變菌落數結果。每組取其3個平行培養皿的平均回變菌落數, 依據出現的致突變比值(如下式計算)檢測Nano-HA材料制品中是否存在誘變物質。

致突變比值(MR)= 實驗組回變菌落數(Rt)/ 陰性對照組回變菌落數(Rc)

2 結果

4個菌株在各個受試濃度待測液在加S9與不加S9的情況下, 致突變比值即實驗組回變菌落數與陰性對照組回變菌落數的比值(Rt/Rc)均<2.0, 而陽性對照組致突變比值則均>2.0, 據此可以認為Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料在Ames試驗中無致突變性。

3 討論

生物相容性是指材料與人體之間相互作用產生各種復雜的生物、物理、化學反應, 以及人體對這些反應的忍受程度［1,2］。根據ISO10993標準的要求, 生物醫學材料長期接觸人體或植入人體內組織、血液應進行潛在的遺傳毒性方面的生物學評價試驗。Ames試驗是由美國的B.N.Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門菌回復突變試驗, 是一種已被公認并廣泛開展的致突變鑒定方法。此方法能夠在短期內檢測醫用材料有無致突變性。

本實驗將Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性納米復合界面固定材料浸提液與各標準菌液混合后在最低營養板上培養, 依據出現的回變菌落數及致突變比值來判斷復合人工骨是否存在誘變物質。考慮到材料是用于植入人體的, 為使實驗條件更接近體內環境, 以排除人體肝細胞微粒體酶系(S9)可能造成的激活誘變作用(間接誘變), 使得實驗更具可信度, 作者在實驗中對把材料浸提液的檢測分為S9(+)組和S9(-)組, 觀察用S9誘發后回變菌落數有無增加。另外, 在操作及觀察結果過程中注意嚴格無菌操作以排除雜菌污染, 進而保證本試驗結果的可靠性。

本試驗結果顯示, 各菌株在各濃度待測液組中回變菌落平均數均未超過其相應陰性對照組回變菌落平均數的2倍(MR<2), 顯示該材料在有、無S9的情況下均無誘變活性；而陽性對照組各菌株回變菌落平均數均超過其相應陰性對照組回變菌落平均數的2倍以上(MR>2), 證實鼠傷寒沙門菌的組氨酸營養缺陷型突變菌株對受試物的檢測有效。本實驗說明此Nano-HA人工骨材料無遺傳毒性作用, 其用于體內植入是安全的, 這為進一步動物實驗及臨床應用提供了依據。

［1］ 郝和平.醫療器械生物學評價標準實施指南.北京:中國標準出版社, 2002:81-135.

［2］ 中華人民共和國衛生部藥政管理局.生物材料和醫療器材生物學評價技術要求.北京:人民衛生出版社, 1997:502-523.

Research of mutagenicity test for magnetic nanometer perforated composite materials

HUANG Yihong, ZHU Wei-min, WANG Da-ping.Department of Rheumatology, Shenzhen City the Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, China

Objective To understand and evaluate the biocompatibility of magnetic nanometer perforated composite materials (Nano-HA/PLLA/Fe2O3) by genetic toxicology, in order to provide reference for its clinical application in tendon transplantion fixation.Methods Suspension was made by Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material for Ames mutagenicity test, in order to detect its mutagenicity ratio (number of revertant bacterial colony in research group/number of revertant bacterial colony in negative control group) for salmonella typhimurium.Results All the 4 strains in different tested concentrations with or without S9 had mutagenicity ratio as number of revertant bacterial colony in experimental group/number of revertant bacterial colony in control group (Rt/Rc) <2.0, while the ratio with positive control group was >2.0.Conclusion Nano-HA/PLLA/Fe2O3magnetic nanometer composite interface fixation material will not induce increasing number of revertant mutation, which suggests this material contains no mutagenicity.

Magnetic nanometer perforated composite material; Mutagenicity test

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.017

2015-02-04］

深圳市科技研發資金項目(項目編號：CXZZ 20130321152713220)；廣東省衛生廳醫學科研基金項目(項目編號：B2012320)；廣東省教育廳育才項目(項目編號：2012LYM_0120)

518035 深圳市第二人民醫院風濕免疫科