酶增強免疫分析法測定環孢素A和他克莫司血藥濃度的質量控制

張麗娟 陳璐

[摘要] 目的 評價和分析酶增強免疫分析法（EMIT）監測患者全血中環孢素A（CsA）和他克莫司濃度的室內質控結果。 方法 對四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部實驗室2013年6月～2014年9月作CsA和他克莫司血藥濃度監測的隨行質控結果進行評價與分析，建立常規中心線及控制限，繪制質控圖。 結果 CsA和他克莫司低、中、高3個水平的常規中心線分別為69.19、159.41、388.11 ng/mL和5.21、9.20、19.34 ng/mL；CsA的低、中、高濃度的日內和日間精密度的RSD分別為10.38%、8.61%、9.40%和16.10%、13.31%、12.64%，相對回收率分別為95.26%、110.65%、107.51%和104.80%、98.30%、98.18%；他克莫司的低、中、高濃度的日內和日間精密度的RSD分別為10.21%、8.69%、4.29%和19.93%、14.02%、13.96%，相對回收率分別為117.20%、107.55%、103.47%和112.20%、105.00%、104.00%，均符合《中國藥典》2010年版的要求。運用Westgard多規則控制方法對質控結果進行分析檢出CsA失控2次；他克莫司失控7次。 結論 EMIT測定CsA和他克莫司血藥濃度具有較好的精密度和穩定性，適于臨床開展治療藥物監測，但應建立質控方法對質控結果進行評估，以保證實驗室測定數據的準確性，為臨床提供準確的監測結果。

[關鍵詞] 環孢素A；他克莫司；質控；酶增強免疫分析法；血藥濃度監測

[中圖分類號] R969.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（c）-0079-05

Enzyme-multiplied immunoassay technique determination of Cyclosporine A and Tacrolimus blood concentration of quality control

ZHANG Lijuan CHEN Lu

Department of Pharmacy， Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People′s Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610072， China

[Abstract] Objective To evaluate and analyze the enzyme-multiplied immunoassay technique （EMIT） to monitor the patient whole blood Cyclosporine A （CsA） and Tacrolimus concentrations of internal quality control results. Methods The quality control results， which were accompanied with blood concentration monitoring of CsA and Tacrolimus in a laboratory from June 2013 to September 2014 were evaluated and analyzed， the conventional centerline and control limits were established， control chart was drawn. Results The low， medium and high levels of conventional centerline of CsA and Tacrolimus were 69.19， 159.41， 388.11 ng/mL and 5.21， 9.20， 19.34 ng/mL respectively. CsA low， medium and high concentrations of intra-day and inter-day precision （RSD） were 10.38%， 8.61%， 9.40% and 16.10%， 13.31%， 12.64%； relative recoveries were 95.26%， 110.65%， 107.51% and 104.80%， 98.30%， 98.18%. Tacrolimus low， medium and high concentrations of intra-day and inter-day precision （RSD） were 10.21%， 8.69%， 4.29% and 19.93%， 14.02%， 13.96%； relative recovery were 117.20%， 107.55%， 103.47% and 112.20%， 105.00%， 104.00%. They were all complied with the requirements of Chinese Pharmacopeia （2010 edition）. Westgard multi-rules control method had detected Tacrolimus with 7 times out of control and CsA with 2 times out of control. Conclusion EMIT assay for CsA and Tacrolimus blood concentration have good precision and stability， and are suitable for clinical therapeutic drug monitoring carrying out. But in order to ensure the laboratory measurement accuracy of the data and to provide accurate monitoring results for clinical use， it should establish quality control methods for quality control.

[Key words] Cyclosporine A； Tacrolimus； Quality control； Enzyme-multiplied immunoassay technique； Therapeutic drug monitoring

開展治療藥物監測，制訂個體化給藥方案，是臨床合理化用藥的一個重要方面。目前環孢素A（CsA）和他克莫司是臨床上最常用的免疫抑制劑，主要用于腎移植、肝移植及骨髓移植等器官移植，由于其治療窗窄，生物利用度個體差異大，同時存在很多不良反應，臨床上多對其進行治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM），實行個體化給藥。不適當的CsA和他克莫司的劑量和水平可能導致對移植器官產生排斥作用，且毒性水平與許多嚴重的為不良反應相關，包括腎毒性、肝毒性以及一系列其他的并發癥[1-4]。

四川省醫學科學院·四川省人民醫院（以下簡稱“我院”）開展治療藥物監測較早，樣本量逐年增大，2013年全年監測例數逾6000余例，因此為保證測定結果的準確性和可靠性，需對酶增強免疫分析法（EMIT）監測CsA和他克莫司血藥濃度實行全過程、全范圍的質量管理[5]。遵循質量控制規則，建立室內質控體系，用以控制監測結果的準確性，并能對系統及隨機誤差及時報警。本研究對我院實驗室2013年6月～2014年9月隨行質控數據進行分析評價。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Viva-E藥物濃度分析儀（德國Siemens公司），微量加樣器（德國Eppendorf公司），HC-2517高速離心機（中國中佳公司），Vortex-Genie渦旋振蕩器（美國Vortex公司），低溫冰箱（中國海爾公司）。

1.2 試劑

CsA檢測試劑盒，包括：抗體試劑（主要含抗CsA鼠單克隆抗體，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸鹽，批號：6R038UL-F4）、酶試劑（主要含用細菌葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標記的CsA，批號：6R078UL-F4）、定標液（批號：6R119UL-F2）、樣本前處理液（批號：6R708UL-G1）；他克莫司檢測試劑盒，包括：抗體試劑（主要含抗他克莫司鼠單克隆抗體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸鹽，批號：8R019UL-F2）、緩沖試劑（主要含三羥甲基氨基甲烷緩沖液，批號：8R019UL-F2）、酶試劑（主要含細菌的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標記的他克莫司，批號：8R019UL-F2）、定標液（批號：8R109UL-F1）、樣本前處理液（批號：8S078UL-F3）；質控品（批號：12840）等，以上試劑均為西門子醫學診斷產品有限公司提供；甲醇為色譜純（美國DIKMA，批號：2851151）。

1.3 樣本

2013年6月更換為新批號的質控品（批號：12840），參照《國家標準臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》需建立此新批號的常規中心線及控制限[6]，并收集2013年6月～2014年9月隨行質控數據進行分析。

2 方法與結果

2.1 血藥濃度監測方法學評價

2.1.1 測定原理

EMIT法檢測CsA和他克莫司是以競爭CsA或他克莫司抗體結合位點為基礎的。樣本中的CsA或他克莫司與酶試劑中的標記有重組酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 （rG6PDH）的CsA或他克莫司發生競爭，有活性的rG6PDH酶將抗體試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉化為還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸（NAD），從而導致的動態吸光度改變，可以用分光光度法進行測量，使與抗體相結合的酶活性下降，從而根據酶活性的變化來確定樣本中CsA或他克莫司濃度。

2.1.2 標準曲線的制備

每次測定前，取出在2～8℃保存的質控品，放至室溫。CsA：精密吸取CsA各濃度（0、50、100、200、350、500 ng/mL）標準全血樣本100 μL加入1.5 mL的離心管中，加入CsA樣本前處理液300 μL，于渦旋振蕩器上充分混勻，放置5 min后于14 000 r/min離心5 min；他克莫司：精密吸取他克莫司各濃度（0、2.5、5、10、20、30 ng/mL）標準全血樣本200 μL、甲醇200 μL和他克莫司樣本前處理液50 μL依次加入1.5 mL離心管中，于渦旋振蕩器上充分混勻，放置5 min后于14 000 r/min離心5 min。離心結束后，傾倒離心管內上清液于樣品管中，上機檢測，儀器自動繪制標準曲線。

2.1.3 質控品的測定

在監測臨床患者樣本的同時，隨行測定CsA和他克莫司的質控品，每次測定依次按低、中、高順序循環隨機進行，測定2013年6月～2014年9月期間使用此新批號的CsA和他克莫司質控品共計290點和293點，建立常規控制中心線及控制限后對余下的180點和175點進行分析。

2.1.4 精密度試驗

2.1.4.1 日內精密度 按“2.1.1”項下方法，同時處理CsA和他克莫司低、中、高質量濃度（65、144、397 ng/mL及5.0、9.8、19.0 ng/mL）的質控樣本，每次測定3種質量濃度的質控樣本各1份，在1 d內每個質量濃度點測5份，計算平均值、相對標準偏差（RSD）和相對回收率，結果見表1。

2.1.4.2 日間精密度 按“2.1.1”項下方法，同時處理CsA和他克莫司低、中、高質量濃度（65、144、397 ng/mL及5.0、9.8、19.0 ng/mL）的質控樣本各1份，連續20 d測定各濃度質控樣本，計算平均值、RSD和相對回收率，結果見表2。

2.2 質控方法

2.2.1 設定控制圖的中心線及控制限

啟用新批號的質控樣品時，根據20次控制測定結果，對數據進行離群值檢驗，計算出平均數及標準差，作為暫定中心線及暫定標準差，以此暫定中心線和暫定標準差作為下1個月室內質控圖的中心線和標準差進行室內質控，1個月結束后，將該月的在控結果與前20次控制測定結果匯集在一起，計算累積中心線和累積標準差，重復3個月[7-8]。累積后的CsA和他克莫司的高、中、低濃度均值分別為69.19、159.41、388.11 ng/mL和5.21、9.20、19.34 ng/mL，以此均值作為該批號質控圖的中心線；標準差分別為16.47、33.27、58.90 ng/mL和1.30、2.10、2.92 ng/mL，以此標準差值確定該批號質控圖的控制限。結果見表3。

2.2.2 Westgard多規則控制方法

采用的是Westgard多規則控制方法來繪制低、中、高濃度的Z-分數質控圖，來評價質控結果。多規則控制方法為12s/13s/22s/R4s/41s/10■。12s警告規則：在某水平的控制值超出（x±2s）限值時，為符合12s規則，發出警告。13s失控規則：控制值超出（x±3s）限值時，為失控。22s失控規則：同一個水平的控制品的連續2次控制值同方向超出（x+2s）或（x-2s）限值，為失控；或兩個水平的控制值同方向超出（x+2s）或（x-2s）限值，為失控。R4s失控規則：在同一批檢測中，1個控制品的控制值超出（x+2s）限值，另一個控制品的控制值超出（x-2s）限值，為失控。41s失控規則：有連續4次的控制值超出了（x+1s）或（x-1s）限值，為失控。10■失控規則：有連續10次的控制值在均值的一側，為失控[9]。

由于本室采用3個質量濃度質控品，按低、中、高順序循環使用，評價時將不同濃度水平的質控測定值轉換成Z-分數形式，繪制在單個質控圖上進行比較。Z-分數質控圖上的值和正負號表示測定值為標準差的倍數和偏離方向，Z-分數=（x測定-x）/s[10-11]。CsA和他克莫司的結果見圖1。從Z-分數控制圖上發現CsA有2次失控，1次違反了41s規則，分別是2014/1/2～2014/1/17的連續4次結果超過了（x+1s）限值，1次違反了22s失控規則，2014/4/30的連續2次中質控超過了（x+2s）限值且第2次超過了（x+3s）。他克莫司有7次失控，1次違反了13s失控規則，為2014/7/4的中質控；3次違反了10■規則，即2014/5/30～2014/6/13、2014/6/18～2014/6/25及2014/9/1～2014/9/15的10次以上測定值在均值一側；2次違反了41s規則，分別是2014/1/13～2014/1/20及2014/8/20～2014/8/22的連續4次結果超過了（x+1s）限值；1次違反了22s失控規則，2014/6/16和2014/6/18的連續2次中質控超過了（x+2s）限值。

3 討論

監測患者全血中CsA和他克莫司的原型藥物濃度，并結合其他實驗室數據以及臨床因素解釋這些濃度，這是確保接受實體器官移植患者的免疫抑制劑治療保持在恰當水平的最有效的方法。本實驗室采用的是酶增強免疫分析法測定CsA和他克莫司全血濃度，EMIT法具有設備簡單，操作方便，檢測時間短等優勢。該方法具有良好的準確度和精密度，方法學試驗結果顯示其符合《中國藥典》2010年版中生物樣品分析方法的要求。顯示用EMIT法測定CsA和他克莫司血藥濃度的長期穩定性較好，適合臨床開展治療藥物監測。

為保證檢測結果準確可靠，我們需要帶入質控樣本進行驗證，采用的是每次測定樣本時隨行帶入質控樣本。選擇的質控方法應既能靈敏地檢出分析誤差（即具有較高的誤差檢出概率），又能特異地識別誤差（即具有較低的假失控概率）[6]。

采用Westgard多規則控制方法繪制3濃度水平的Z-分數質控圖，來評價質控結果[12]。則可以及時發現隨機誤差（通過13s規則和R4s規則）和系統誤差（通過22s規則、41s規則和10■規則），具有低的假失控率，誤差檢出能力強。共檢出CsA 2次失控，他克莫司7次失控。分析失控原因，他克莫司中2014/1/2～2014/1/17違反了41s規則和2014/5/30～2014/6/13、2014/6/18～2014/6/25違反了10■規則，CsA中2014/1/2～2014/1/17違反了41s規則為溫度過低或過高不能很好的控制在適宜的溫度范圍內造成的，將實驗室內空調提前幾小時設置在合適的溫度，使儀器內部管路和試劑盒恒定在適宜的溫度條件下進樣，結果在控。他克莫司中2014/6/16～2014/6/18和CsA中2014/4/30的連續2次中質控超過了（x±2s）限值和他克莫司中2014/7/4的中質控違反了13s失控規則的失控原因為“瓶底效應”造成的，更換新的試劑盒后結果在控。他克莫司中2014/8/20～2014/8/22違反了41s規則和2014/9/1～2014/9/15違反了10■規則的失控原因為標準曲線的漂移，重新定標后，結果在控。

根據質控圖來判斷質控結果，當室內質控“在控”時發出監測結果，當室內質控“失控”時，及時查明失控原因后再發出監測結果。根據質控圖來判斷是否存在漂移趨勢性變化，分析出現這種定向趨勢的原因，排查誤差并分析可能存在的影響因素并及時糾正，以確保血藥濃度監測結果的準確可靠[13-14]。

實驗記錄中應對操作人員、試劑批號、定標日期、冰箱溫度、實驗室環境、儀器的校正及故障、測定過程中的異常現象等均應詳細記錄，以便及時發現問題并解決問題。在監測中發現EMIT法受溫、濕度及空氣潔凈度等環境因素的影響較大，為保持儀器的靈敏度和精密度，需控制好環境因素，并做好實驗記錄，及時發現問題。監測時實驗室的溫度應盡量控制在恒溫，溫差不能太大，且操作時的溫度與定標時的溫度要保持一致[15-16]。試驗中也發現在冬天和夏天，室溫不易控制在恒溫時，測定的結果偏差較大。EMIT法的試劑價格昂貴，故應按照說明書要求來儲存試劑，在保證結果準確可靠的同時，避免不必要的經濟損失；試劑在2～8℃條件下貯存，開封后需在12周或有效期內使用。應用EMIT法監測血藥濃度時，會發生“試劑瓶底效應”影響測定結果[17]，在本實驗室的監測工作中也發現試劑反復使用多次后剩余少量試劑時，會出現結果的漂移。及時繪制質控圖，及時發現漂移，及時更換新的試劑盒，從而保證監測結果的準確性。

綜上所述，EMIT法測定CsA和他克莫司血藥濃度準確可靠，但應建立質量控制體系對測定過程進行監控，為合理用藥提供真實可靠的依據。

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（收稿日期：2014-09-11 本文編輯：衛 軻）