去甲斑蝥素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡作用的研究

張日沅 林勝璋 陳翀 王盈盈 徐賢綢

去甲斑蝥素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡作用的研究

張日沅 林勝璋 陳翀 王盈盈 徐賢綢

目的探討去甲斑蝥素對人胰腺癌PANC-1細胞凋亡的作用及其機制。方法將PANC-1細胞株隨機分為處理組和對照組，處理組加入不同濃度的去甲斑蝥素培養(yǎng)24h后，CCK-8法檢測細胞增殖情況；流式細胞術(shù)分析細胞的凋亡情況；免疫印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達；熒光定量PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白m RNA表達。結(jié)果不同濃度去甲斑蝥素處理PANC-1細胞24h后，與對照組相比，能降低細胞的存活率并誘導(dǎo)其凋亡。與對照組相比，處理組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的表達水平均上調(diào)（均P＜0．05），同時其m RNA的表達水平亦均上調(diào)（均P＜0．05）。結(jié)論去甲斑蝥素能明顯抑制人胰腺癌PANC-1細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡，并且具有濃度依賴性，這一作用可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑實現(xiàn)的。

胰腺癌 去甲斑蝥素 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其起病隱襲，病情進展迅速，且早期診斷率低，預(yù)后差[1]。近年來尋找新型的抗腫瘤藥是治療腫瘤的趨勢[2]。體內(nèi)外研究證實中藥單體能高效、安全地抑制腫瘤細胞增殖，并且無肝腎功能損害，不引起骨髓抑制還能增強免疫功能。本研究探討中藥單體去甲斑蝥素抗胰腺癌的機制，為其治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 去甲斑蝥素（美國Sigma公司）；人胰腺癌細胞系PANC-1（中國科學(xué)院上海細胞庫）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素-鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8 kit）（日本Dojindo公司）；Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BioVision公司）；小鼠抗人GADD153抗體、小鼠抗人ATF4抗體、兔抗人GRP78抗體（英國Abcam公司）；兔抗人phospho-PERK（Thr980）抗體、兔抗人phospho-eIF2α（Ser51）抗體、兔抗人cleaved caspase-3（Asp175）抗體、兔抗人β-tubulin抗體（美國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 PANC-1細胞培養(yǎng) PANC-1細胞在含10%滅活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。使用容積為60ml、培養(yǎng)面積為25cm2的斜頸帶濾膜的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，盛約5ml的完全培養(yǎng)基。細胞呈單層貼壁生長，生長至80%～90%時傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期PANC-1細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。每孔總體積100μl，細胞培養(yǎng)24h后加藥物處理，分對照組（0.1%DMSO溶液）和處理組；處理組再根據(jù)添加的去甲斑蝥素濃度分為A組（10μmol/L）、B組（50μmol/L）、C組（75μmol/L）、D組（100μmol/L）、E組（150μmol/L）、F組（200μmol/L）；每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后每孔加入10μl的CCK-8溶液和100μl不含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4h，酶標儀測A450值，實驗重復(fù)3次，計算24h細胞存活率[細胞存活率=（處理組A450值-空白調(diào)零A450值）/（對照組A450值-空白調(diào)零A450值）×100%]。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期PANC-1細胞，接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24h后加藥物處理分組（分組法同前），實驗重復(fù)3次。將細胞重懸于500μl Binding buffer中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，室溫下避光孵育5min后在流式細胞儀上進行檢測。流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長＞560nm的濾器檢測PI。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 于6孔板中收集對數(shù)生長期PANC-1細胞，藥物處理分組（分組法同前），細胞裂解液作用后，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，之后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1.5 h，并置于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、ATF4、GADD153、cleaved caspase-3和內(nèi)參蛋白β-tubulin中參與免疫反應(yīng)，最后化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，膠片掃描，以各蛋白與β-tubulin灰度比值表示蛋白表達水平。

1.2.5 熒光定量PCR 收集對數(shù)生長期PANC-1細胞，接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)24 h后加藥物處理分組（分組法同前）。實驗重復(fù)3次。進行RNA提取以及RNA濃度的測定，采用美國Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄，采用日本Toyobo公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-試劑盒進行PCR擴增，檢測基因表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組PANC-1細胞24h存活率、凋亡率的比較 見表1。

表1 各組PANC-1細胞24h存活率、凋亡率的比較（%）

由表1可見，除A組外，處理組與對照組的細胞24h存活率、凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；并且，去甲斑蝥素對PANC-1細胞24h存活率的半抑制濃度約100μmol/l。

2.2 Western blot檢測各組PANC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達水平 見圖1、表2。

圖1 Western blot檢測各組PANC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達水平電泳圖

由圖1可見，處理組較對照組Western blot結(jié)果蛋白表達灰度高。由表2可見，除A組外，處理組較對照組GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3蛋白的表達水平均上調(diào)（均P＜0.05）；除A、B、C組外，D、E、F組較對照組GADD153蛋白的表達水平均上調(diào)（均P＜0.05）。

2.3 各組PANC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達水平比較 見表3。

由表3可見，除A組外，處理組與對照組比較，PANC-1細胞GRP78、phospho-eIF2α、phospho-PERK、ATF4、cleaved caspase-3mRNA的表達水平均上調(diào)（均P＜0.05）；除A、B、C組外，D、E、F組較對照組GADD153 mRNA的表達水平亦均上調(diào)（均P＜0.05）。

表2 各組PANC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

表3 各組PANC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達水平比較

3 討論

去甲斑蝥素是從傳統(tǒng)中藥中提取并經(jīng)人工合成的一種新型低毒的抗腫瘤藥物，具有較強的抗腫瘤活性和獨特的升高血白細胞作用。去甲斑蝥素抑制肝癌和結(jié)腸癌等腫瘤細胞的增殖,可能機制是誘導(dǎo)細胞凋亡[3-4]，但對于其抗胰腺癌作用的機制仍沒有完全的認識。本研究觀察了去甲斑蝥素對人胰腺癌PANC-1細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，去甲斑蝥素對PANC-1細胞的生長有明顯抑制作用，并呈濃度依賴關(guān)系。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示去甲斑蝥素可通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮抑制PANC-1細胞生長的作用。

介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的途徑很多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑是一種新的凋亡途徑[5-7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是各種分泌蛋白和膜蛋白合成與折疊的一種細胞器。多種生理或病理情況下，例如蛋白質(zhì)糖基化的抑制、蛋白質(zhì)不能形成正常的二硫鍵結(jié)合、突變蛋白表達以及氧化還原狀態(tài)的改變等均會引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[8]。發(fā)生ERS時，細胞內(nèi)GRP78結(jié)合未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)，誘發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)，激活ERK/eIF2α/ ATF4、ATF6和IRE-1/XBP-1 3條信號途徑，增強對蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的處理能力，以利于維持細胞的正常功能[9]。其中，GRP78是ERS的標志性特異分子。如果細胞損傷太過嚴重或時間太過長久，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時恢復(fù)，ERS可以激活下游的凋亡信號分子GADD153，誘導(dǎo)細胞凋亡，從而去除受損傷的細胞[10]。以此假設(shè)：去甲斑蝥素亦可通過ERS介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡。Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示，去甲斑蝥素明顯上調(diào)GRP78蛋白和基因的表達水平，并且GRP78上調(diào)的水平和細胞凋亡的水平一致。此外Western blot結(jié)果還顯示，ERS的其他反應(yīng)蛋白，如磷酸化PERK、磷酸化eIF2α和ATF4在經(jīng)去甲斑蝥素處理PANC-1細胞中表達明顯增高。這些結(jié)果表明ERS在去甲斑蝥素誘導(dǎo)的PANC-1細胞凋亡中起了重要作用。

綜上所述，本研究顯示去甲斑蝥素對PANC-1細胞具有生長抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用，其可能的機制是去甲斑蝥素可通過ERS介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)PANC-1細胞凋亡。此結(jié)果對去甲斑蝥素在抗胰腺癌的臨床應(yīng)用及其機制研究有指導(dǎo)作用。本實驗僅在體外條件下研究了去甲斑蝥素對人胰腺癌PANC-1細胞的生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及其機制，還需完成在動物體內(nèi)進一步的實驗研究。

[1]Vincent A,Herm an J,Schulick R,et al．Panc reatic cancer[J]．Lancet,2011,378(9791):607-620．

[2]劉岸,羅江,張堅紅,等．大黃素聯(lián)合吉西他濱抑制體內(nèi)外胰腺癌生長及其機制研究[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(5):652-656．

[3]王清,賈雪梅,王淑玉,等．姜黃素對人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響[J]．江蘇醫(yī)藥,2005,31(3):217-218．

[4]Chen YN,Chen J C,Yin S C,et al．Effectorm echanism s of norcantharid in-induced m itotic arrest and apop tosis in hum an hepatoma cells[J]．Int JCancer,2002,100(2):158-165．

[5]Zinszner H,Kuroda M,Wang X,eta l．CHOP is im p licated in p rog rammed celldeath in response to impaired function of the endop lasm ic reticulum[J]．Genes Dev,1998,12(7):982-995．

[6]Marciniak S J,Yun C Y,Oyadom ariS,etal．CHOP induces death by p romoting p rotein synthesis and oxidation in the stressed endop lasm ic reticulum[J]．Genes Dev,2004,18(24):3066-3077．

[7]Rao RV,Ellerby HM,Bredesen D E．Coup ling endop lasm ic reticulum stress to the celldeath p rog ram[J]．CellDeath Differ,2004,11 (4):372-380．

[8]Rasheva V I,Dom ingos PM．Cellular responses to endop lasm ic reticulum stress and apop tosis[J]．Apop tosis,2009,14(8):996-1007．

[9]Walter P,Ron D．The unfolded p rotein response:from stress pathway to hom eostatic regu lation[J]．Science,2011,334(6059): 1081-1086．

[10]Tabas I,Ron D．Integ rating the mechanism s of apop tosis induced by endop lasm ic reticulum stress[J]．NatCe llBiol,2011,13 (3):184-190．

ObjectiveTo investigate the effect of norcantharidin on human panc reatic cancer PANC-1 cells． Methods PANC-1 cells were cultured w ith 0．1%DMSO and norcantharid in(0,10,50,75,100,150,200μmol/L)for24h．The grow th inhibitory effectwas observed by using CCK-8,cellapop tosis was determ ined by flow cytometry(FCM)．The exp ressions of endop lasm ic reticulum stress(ERS)markers were detected byWestern b lot,exp ressions ofGRP78 and GADD153m RNAwere detected by real-time PCR afterexposure to norcantharid in．ResultsCCK-8 assay showed thatnorcantharidin significant inhibited the grow th of PANC-1 cells．Apop tosis rates of PANC-1 cells treated w ith norcantharid in were significantly higher than those of control g roup．Western b lotanalysis showed that norcantharidin up-regulated ERSmarkers(P＜0．05)．Real-time PCR showed that the exp ression ofGRP78 and GADD153mRNA in PANC-1 cells treated w ith norcantharid in was higher than thatof controlgroup(P＜0．05)．ConclusionNorcantharid in can inhibit the g row th of human pancreatic cancer PANC-1 cells and induce cell apop tosis．ERS-mediated apop tosis pathwaymay be involved in norcantharid in-induced apop tosis in pancreatic cancer PANC-1 cells．

Pancreatic cancer Norcantharid in Apop tosis Endop lasm ic reticulum stress

2014-03-26）

（本文編輯：李媚）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科（張日沅、林勝璋，張日沅為研究生，現(xiàn)在平陽縣人民醫(yī)院普外科工作）；平陽縣人民醫(yī)院普外科（陳翀、王盈盈、徐賢綢）

張日沅，E-mail：pyzry2013@163.com