低氧血癥對輕型顱腦損傷大鼠海馬結構二次腦損傷的實驗研究

王洪財 王波定 陳海 陳茂送 孫成豐 沈罡 馬延斌

低氧血癥對輕型顱腦損傷大鼠海馬結構二次腦損傷的實驗研究

王洪財 王波定 陳海 陳茂送 孫成豐 沈罡 馬延斌

目的應用低氧血癥二次腦損傷大鼠模型，探討低氧血癥對輕型顱腦損傷（m TBI）后海馬神經元及軸索組織結構的二次損傷作用。方法采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組（8只）、單純m TBI組（10只）、單純低氧血癥組（10只）及低氧血癥二次腦損傷組（10只）。在自制旋轉裝置致大鼠m TBI基礎上，利用動物呼吸機獲得控制性低氧血癥，從而構建低氧血癥二次腦損傷模型。腦損傷后1周，應用HE染色、免疫組化β-APP染色及電鏡觀察大鼠海馬組織結構病理學變化。結果HE染色發現單純低氧血癥組大鼠海馬神經元結構完整、排列有序、神經組織結構致密、未見明顯神經元丟失及神經組織結構疏松等病理變化，單純m TBI組及低氧血癥二次腦損傷組大鼠均出現海馬神經元腫脹、胞質淡染、密度降低、排列不規則及神經組織結構疏松等損傷表現，但低氧血癥二次腦損傷組較單純m TBI組明顯。免疫組化β-APP染色及電鏡觀察到低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬存在軸索腫脹扭曲變形、髓鞘板層分離及軸索球形成等軸索損傷表現。 結論 低氧血癥二次腦損傷可明顯加重m TBI后海馬神經元及軸索組織結構的損傷，及早預防、發現和治療低氧血癥對改善m TBI患者預后具有積極意義。

低氧血癥 輕型顱腦損傷 二次腦損傷

隨著交通物流業及建筑業的發展，顱腦損傷（TBI）發病率呈不斷上升趨勢，其增長速度已超過全球人口的增長速度，被學者稱之為“靜息性流行病”，現已成為全球關注的社會公共衛生問題[1]。輕型TBI（mTBI）是TBI中最為常見的損傷類型，由于臨床表現各異且癥狀輕微，一直未受臨床醫生所重視，其相應的基礎研究更為薄弱[2]。近年來國內外研究表明，部分mTBI患者即使頭顱CT及常規MR檢查表現正常，事實上也存在神經組織病理學改變，尤其是海馬區域神經組織結構的損傷[3]。此外，部分mTBI患者在疾病過程中尤其是創傷急性期，可因胸腹部多發傷伴發低氧血癥等二次腦損傷因素而導致病情惡化及后遺癥發生[4]。為此，本研究建立了低氧血癥二次腦損傷大鼠模型，以進一步探討低氧血癥對mTBI后海馬組織結構的二次損傷作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠38只，體重300～350g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院動物實驗室。免疫組化β-APP抗體購于英國Abcam公司，Olympus IX51型倒置熒光顯微鏡為日本Olympus公司產品，Philips CM-120透射電鏡為荷蘭Philips公司產品。

1.2 實驗動物分組及模型建立 將大鼠單籠依次標簽，采用隨機數字表法分為正常對照組（8只）和損傷組（30只），其中損傷組分為單純mTBI組（10只）、單純低氧血癥組（10只）及低氧血癥二次腦損傷組（10只）。低氧血癥二次腦損傷組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，待角膜反射消失后，行氣管插管、小型動物呼吸機（Harvard Apparatus 683，美國）輔助呼吸，右側股動脈插管監測平均動脈壓、輸液及取樣；應用自制顱腦致傷裝置（專利號：ZL200810201615.5）使大鼠發生90°整體瞬間加速旋轉運動而產生mTBI[5]，傷后即刻予11%氧氣通氣30 min造成低氧血癥，血氣分析提示PaO2為（38±3）mmHg，動脈血血氧飽和度（SpO2）為（56±3）%[6]。二次腦損傷后置于正常室內空氣中。單純mTBI組大鼠接受旋轉運動無后續低氧血癥建立過程，而單純低氧血癥組大鼠無旋轉運動而直接行11%氧氣通氣30min，血氣分析PaO2為（39±3）mmHg，SpO2為（57±2）%。正常對照組大鼠除無旋轉運動和低氧血癥建立過程外，其他操作同損傷組。大鼠傷后不進行搶救及其他特殊治療，觀察大鼠呼吸變化、肢體抽搐、蘇醒后肢體活動及反應能力等情況。等大鼠恢復自主活動后，回籠繼續原有飼料飼養。模型建立后1周，記錄大鼠死亡數目，計算死亡率并行組織病理學檢測。

1.3 組織病理學檢測

1.3.1 光鏡標本制備 各組大鼠麻醉滿意后，快速開胸行升主動脈插管，剪開右心房，先后以0.9%氯化鈉注射液100ml快速沖洗、4%多聚甲醛350ml先快后慢行腦灌注固定?？焖匍_顱大體標本觀察后，行腦冠狀面3～4 mm連續切片，4%多聚甲醛4℃固定24h，常規脫水、石蠟包埋，HE常規染色及免疫組化β-APP染色（抗體1∶300稀釋，LSAB法染色）。光鏡標本在Olympus IX51型倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 透射電鏡標本制備 各組中隨機抽取2只大鼠標本行電鏡檢查，以2%戊二醛350ml灌注固定后，快速開顱取海馬CA3處大小1mm×1mm×3mm腦組織，再以2%戊二醛4℃固定24h，鋨酸染色后固定，環氧樹脂包埋，超薄切片后Philips CM-120透射電鏡觀察。

1.3.3 組織病理學檢測 在HE染色結果基礎上對海馬CA3區域進行神經元計數，然后取平均數。神經元計數方法如下：每只動物取2張切片，切片定位于前囟后3.8mm，在400倍鏡下計數連續4個視野，計數有完整胞體和細胞核的神經元。應用免疫組化β-APP染色來評估各損傷組大鼠海馬區域軸索損傷情況。所有神經元計數及陽性軸索染色判讀均由同1位經驗豐富的神經病理學醫師執行。

1.4 統計學處理 應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料均采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和SNK檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡情況及行為學觀察 正常對照組、單純mTBI組及單純低氧血癥組大鼠傷后1周無死亡現象。低氧血癥二次腦損傷組大鼠死亡2只，死亡率為20.0%。死亡大鼠在低氧血癥建立后即出現呼吸持續淺促，間歇性肢體抽搐呈去腦強直狀，90min內出現死亡。其余大鼠傷后多數出現10余秒張口急促呼吸，后呼吸淺促夾雜數次深幅呼吸、肢體抽搐及大小便失禁，置室內空氣30min后呼吸漸平穩、SpO2和PaO2基本恢復受傷前水平。蘇醒后大鼠精神差，蜷伏不動，反應下降，覓食活動減少，上述行為學抑制持續時間約4h。單純mTBI組大鼠亦出現短暫呼吸暫停及行為學抑制等表現，但上述變化在2h內恢復。單純低氧血癥組和正常對照組大鼠無上述現象，呼吸保持平穩、麻醉蘇醒后活動基本同麻醉前。

2.2 各組大鼠海馬區神經元組織病理學觀察

2.2.1 光鏡觀察 光鏡下HE染色發現低氧血癥二次腦損傷組海馬區域神經元密度降低，排列不規則，神經元腫脹，胞質淡染，神經元周邊呈空泡狀，神經組織結構疏松，并可見神經元變性壞死（見圖1A）。單純mTBI組亦見神經元減少及神經組織結構絮亂疏松等組織學改變，但較低氧血癥二次腦損傷組輕（見圖1B）。單純低氧血癥組和正常對照組鏡下可見神經元及軸索排列有序，神經組織結構致密，未見神經元丟失及神經組織結構疏松等病理變化（見圖1C-D）。

2.2.2 電鏡觀察 電鏡下可見低氧血癥二次腦損傷組大鼠神經元內線粒體腫脹、尼氏小體消失及胞質空泡化等超微病理學變化，并見神經軸索腫脹迂曲，軸索內微管消失、微絲聚集，線粒體腫脹，髓鞘板層分離與軸索膜形成低電子密度區，軸索膜破裂、軸漿外溢形成斷端軸索球等軸索損傷征象（見圖2A）。單純mTBI組除可見類似的神經元損傷病理改變外，未見明顯軸索損傷征象（見圖2B）。單純低氧血癥組和正常對照組則無明顯神 經元及軸索損傷的征象（見圖2C-D）。

圖1 各組大鼠海馬區神經元組織病理學觀察（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：單純mTBI組；C：單純低氧血癥組；D：正常對照組；HE染色，×200）

圖2 各組大鼠海馬區神經元電鏡觀察（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：單純mTBI組；C：單純低氧血癥組；D：正常對照組；鋨酸染色，×13 500）

2.2.3 免疫組化檢測 免疫組化β-APP染色觀察到低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬區域神經元呈強陽性染色，并見神經軸索迂曲腫脹、串珠樣改變及軸索斷裂形成軸索球等軸索損傷表現（見圖3A）。單純mTBI組神經元呈弱陽性染色，且未現軸索陽性染色（見圖3B）；單純低氧血癥組和正常對照組神經元及軸索均未出現陽性染色（見圖3C-D）。

圖3 各組大鼠海馬區神經元免疫組化β-APP染色（A：低氧血癥二次腦損傷組；B：單純mTBI組；C：單純低氧血癥組；D：正常對照組；免疫組化LSAB法染色，×100）

2.3 各組大鼠海馬區域神經元計數 模型建立后1周，低氧血癥二次腦損傷組大鼠海馬CA3區域內神經元計數分別為（127±11）個，單純mTBI組為（159±15）個、單純低氧血癥組（181±19）個，正常對照組（191±23）個。低氧血癥二次腦損傷組及單純mTBI組神經元計數與其他兩組比較均有統計學差異（F=9.47、3.75，均P＜0.05），且低氧血癥二次腦損傷組比單純mTBI組神經元數目減少更為明顯（t=5.035，P＜0.05）。單純低氧血癥組神經元數目減少，但與正常對照組比較無統計學差異（t=1.060，P＞0.05）。

3 討論

TBI是造成當今世界青壯年重度殘疾和死亡的首要病因，且治療難、預后差，長期持續存在的神經功能缺失給家庭和社會增加了巨大的醫療負擔，現已成為全球關注的嚴重社會公共衛生問題[1]。mTBI是臨床最常見的TBI類型，約占TBI發病率的70.0%～80.0%。由于其臨床表現各異且癥狀輕微，一直不被臨床醫生所重視，因此目前mTBI診斷及治療仍不完善，相應的基礎研究更未廣泛開展。隨著功能MR技術的發展及相關研究的進展，國內外研究發現mTBI可引起患者認知功能障礙、神經行為絮亂、記憶力減退及注意力不集中等神經精神癥狀，甚至可導致軀體運動感覺功能障礙；部分患者即使頭顱CT及常規MR表現正常，也可能存在神經組織病理改變[3,7]。此外，mTBI患者在其疾病過程中尤其是創傷急性期，可因誤吸、創傷性濕肺和胸腹部損傷而伴發低氧血癥、低血壓等二次腦損傷因素導致患者病情惡化及后遺癥發生[4，6]。

二次腦損傷是指在原發性腦損傷后，由于低氧血癥、低血壓及高熱等因素造成的顱內壓、腦灌注壓及腦代謝率等的異常改變，進而加重原發性腦損傷并延長其病理生理損傷過程。國外臨床研究表明，在TBI中二次腦損傷的發生率為44.5%，TBI患者合并二次腦損傷時致殘率和病死率均顯著提高[8-9]。本研究結果同樣提示，在單純mTBI或低氧血癥情況下，大鼠行為學抑制能較快恢復且未出現死亡情況，而低氧血癥二次腦損傷組大鼠死亡率高達20.0%，且行為學抑制時間明顯延長。眾多臨床研究表明在TBI中低氧血癥較其他二次腦損傷因素更常見。一項關于TBI患者直升機轉運的研究發現，55.0%的TBI患者在氣管插管前曾發生過低氧血癥，而這些低氧血癥患者中，46.0%未合并低血壓[10]。腦組織耗氧量大、對缺氧極其敏感，故低氧血癥的發生可嚴重影響患者神經功能康復及預后。國內外學者對于TBI患者合并低氧血癥進行了大量的臨床統計工作，但相對統一標準的TBI合并低氧血癥的二次腦損傷模型至今在國內尚未建立，相關基礎研究甚少[11]。國外部分學者構建了低氧血癥二次腦損傷模型，但主要限于中重型TBI而鮮有mTBI，并且低氧血癥建立的條件和方式差異較大[12-13]。為此，在穩定可靠的低氧血癥二次腦損傷模型基礎上，探討低氧血癥對mTBI后神經組織結構的損傷，有利于進一步認識低氧血癥二次腦損傷，也為其臨床診治提供更多的線索和依據。

國外多項研究報道低氧血癥可加重局灶性中重型TBI實驗動物模型的皮層神經元損傷、加劇神經炎癥反應、加重腦水腫、擾亂細胞代謝、延長組織病理損傷過程并導致感覺、運動和認知功能惡化[12-14]。海馬作為大腦邊緣系統的重要組成部分，該區域神經元及軸索連接與學習記憶功能密切相關，TBI后海馬區域神經組織結構的損傷是傷后認知、記憶功能障礙的主要原因。既往研究表明海馬CA3區域神經元對損傷有著特殊敏感性，在傷后此區域神經元容易發生變性、壞死及凋亡[6]。本研究在自制mTBI聯合低氧血癥動物模型基礎上，利用HE染色、免疫組化和電鏡技術來觀察低氧血癥對mTBI后海馬組織結構的損傷作用。組織病理學檢測表明單純mTBI后海馬CA3區域神經元出現密度降低、排列不規則、神經組織結構疏松及神經元變性壞死等損傷征象，但無明顯軸索結構損傷。單純限時性低氧血癥后海馬區域神經元數目減少，但與正常對照組比較無統計學差異，且不存在神經軸索損傷。這與Dolinak等[15]研究結果一致，即單純限時性低氧血癥并不易造成神經軸索損傷。mTBI合并低氧血癥后，海馬CA3區域神經元損傷征象更為明顯，神經元數目減少，與單純mTBI組比較存在統計學差異。此外，神經軸索出現腫脹迂曲、髓鞘板層分離及軸索斷裂形成軸索球等損傷表現。mTBI合并低氧血癥后出現明顯的海馬組織結構損傷，這可能與mTBI后腦血管自動調節功能受損，導致腦組織對于后繼腦損傷因素易損性增加相關，而正常腦組織存在著良好的腦血管自動調節功能、在單純低氧血癥情況下腦組織可通過擴張腦血管來代償缺氧[16]。此外，也可能與mTBI后神經元代謝增加、興奮性氨基酸增多及線粒體功能障礙等因素相關[17]。

綜上所述，本研究發現單純限時性低氧血癥對海馬神經元及軸索結構損傷作用不明顯，然而在mTBI后發生低氧血癥即可出現明顯的神經組織結構損傷。這提示mTBI后腦組織易損性增加，積極預防及糾正低氧血癥對改善mTBI患者預后具有積極意義。

[1]Kenney K,Diaz-Arrastia R．Review of traumatic b rain and sp ina l cord injury:challenges and deve lopments[J]．JAMA Neuro l,2013, 70(10):1333．

[2]Vos PE,Alekseenko Y,Battistin L,eta l．Mild traumatic b rain injury [J]．Eur JNeurol,2012,19(2):191-198．

[3]Mayer AR,Ling J,Manne llM V,etal．A p rospective d iffusion tensor imaging study in m ild traum atic b rain in jury[J]．Neurology, 2010,74(8):643-650．

[4]McHugh G S,EngelD C,Butcher I,eta l．Prognostic va lue ofsecondary insults in traumatic b rain injury:results from the IMPACT study[J]．JNeurotrauma,2007,24(2):287-293．

[5]Wang H C,Duan ZX,Wu FF,etal．A new ratm odel for d iffuse axonalinjury with linear acceleration and angular acceleration combined[J]．JNeurotraum a,2010,27(4):707-719．

[6]朱坤燦,王洪財,陳海,等．大鼠低氧血癥性二次腦損傷模型的建立[J]．中華實驗外科雜志,2014,31(10):2332-2334．

[7]Max J E,Schachar R J,Land is J,et al．Psychiatric d isorders in child ren and ado lescents in the first six m onths afterm ild traumatic b rain in jury[J]．JNeuropsychiatry Clin Neurosci,2013,25(3): 187-197．

[8]Maas A I,Marm arou A,Murray G D,etal．Prognosis and c linicaltria l design in traumatic b rain injury:the IMPACT study[J]．J Neurotraum a,2007,24(2):232-238．

[9]Kochanek P M,Robert S B C,Larry W J．Pathobiology of Secondary Brain Injury[M]//Nathan D Z,Doug las IK,Ross D Z．2nd ed ition．Brain Injury Med icine:Princip les and Practice．New York:Demos Med icalPub lishing,2012:148．

[10]StochettiN,Furlan A,Volta F．Hypoxem ia and arteria lhypotension at the accident scene in head injury[J]．J Traum a,1996,40 (5):764-767．

[11]王波定,王洪財,朱坤燦,等．創傷性腦損傷模型的延續與完善:二次腦損傷模型[J]．中華神經醫學雜志,2013,12(4):426-429．

[12]Feng JF,Zhao X,Gurko ffG G,etal．Post-traum atic hypoxia exacerbates neuronalcelldeath in the hippocampus[J]．JNeurotraum a,2012,29(6):1167-1179．

[13]Yan EB,He llewellSC,Bellander BM,etal．Post-traumatic hypoxia exacerbates neurolog ical de ficit,neuroinflammation and cereb ralm etabolism in rats with d iffuse traumatic b rain in jury[J]．JNeuroinflammation,2011,28(8):147-163．

[14]Baum an R A,Widholm J,Long JB．Secondary hypoxia exacerbates acute d isrup tions of energy m etabolism in rats resulting from fluid percussion injury[J]．Behav Brain Res,2005,160(1): 25-33．

[15]Do linak D,Sm ith C,Graham D I．G lobalhypoxia per se is an unusualcause of axonal injury[J]．Acta Neuropathol,2000,100(5): 553-560．

[16]Metting Z,Ro d iger L A,Stewart R E,et al．Perfusion computed tomog raphy in the acute phase of m ild head injury:regiona l dysfunction and p rognostic value[J]．Ann Neuro l,2009,66(6): 809-816．

[17]Prins M L,Alexander D,Giza C C,etal．Repeated m ild traum atic b rain injury:mechanisms of cereb ral vulnerab ility[J]．J Neurotrauma,2013,30(1):30-38．

ObjectiveTo investigate the effec ts of post-traumatic hypoxem ia on m ild traumatic brain injury(m TBI)in rats．MethodsThe experimentalmodelwas estab lished by instantly rotating 90 degree followed by hypoxem ic insult in rats．Animals in g roup 1 were sub jected to p rimarym TBIand subsequenthypoxem ia(n=10);animals in g roup 2 were sub jec ts tom TBI only(n=10);animals in group 3 underwenthypoxem ia only(n=10)and animals in group 4 served as the controls(n=8)．Pathological and behavioralexam inations were conducted 1 week after injury．ResultsAll rats in group 2 and 3 survived afterm TBIor hypoxem ia,whereas 2 animals d ied in g roup 1 w ith amortality rate of20．0%．Histologicalexam ination ofHE-stained sections,electronm ic roscope,andβ-APP immunohistochem istry revealed the p resence ofneuronaland axonalinjury in CA3 ofhippocam pus in rats of group 1．Pathological changes of neuronal injury in g roup 2 were exhibited,but no add itional axonal damage was demonstrated．The above changes were not found in g roups 3 and 4．ConclusionThe combination of p rimary m TBIand secondary hypoxem ia can cause synergistic effects to p roduce significantly pathologicalchanges in CA3 ofhippocam pus in rats．

Hypoxem ia Mild traumatic b rain injury Secondary b rain injury

2015-01-04）

（本文編輯：胥昀）

寧波市自然科學基金項目（2011A610041）；寧波市科學技術基金項目（2013A05）

315040 寧波市醫療中心李惠利醫院神經外科（王洪財、王波定、陳海、陳茂送、孫成豐、沈罡）；上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院神經外科（馬延斌）

王波定，E-mail：Roger0412@126.com