人外周血巨噬細胞培養及功能鑒定①

林煒明 戴愛玲 尹會方 楊小燕 (龍巖學院生命科學學院，龍巖 364000)

人外周血巨噬細胞培養及功能鑒定①

林煒明 戴愛玲 尹會方 楊小燕②(龍巖學院生命科學學院，龍巖 364000)

目的:從人外周血單個核細胞(PBMC)中分離單核細胞，誘導分化成巨噬細胞并鑒定其功能。方法:應用免疫磁珠法從人外周血單個核細胞中分選CD14+單核細胞，分離后的細胞用流式細胞儀檢測其純度，用含有10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養基體外培養CD14+單核細胞，誘導分化成巨噬細胞，并進行形態特征和吞噬功能鑒定。結果:免疫磁珠法能從外周血中分離到高純度的CD14+單核細胞，分選前CD14陽性率為10%，分選后CD14陽性率為85.8%。誘導培養7天后巨噬細胞的直徑最大可達40～45 μm，大部分細胞呈煎蛋狀，能有效地吞噬淋巴瘤Raji細胞。結論:從外周血中分離了高純度的CD14+單核細胞，誘導形成的巨噬細胞具有吞噬淋巴瘤細胞的功能。

巨噬細胞;磁珠分選;培養;功能鑒定

單核-巨噬細胞系統包括血液中的單核細胞和組織中固定或游走的巨噬細胞，具有吞噬功能。單核細胞來源于骨髓干細胞，在骨髓中經前單核細胞分化發育為單核細胞，然后由骨髓釋放入血，經過血液循環便移行到各個組織中，分化成組織中的巨噬細胞。所有巨噬細胞包括炎癥位點和穩態下定居于組織中的均由單核細胞衍生而來[1]。在體外培養時，單核細胞在含有血清或巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)培養中分化成巨噬細胞[2]。CD14是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細胞膜表面的糖蛋白，分布于單核細胞、巨噬細胞膜表面脂質豐富的區域，而在內皮細胞、上皮細胞等表面則未發現CD14的存在，目前已被廣泛用來鑒定單核巨噬細胞[3，4]。本實驗通過采集健康成人新鮮外周血，應用免疫磁珠法捕獲CD14+單核細胞，經體外培養分化為巨噬細胞，建立高純度的人外周血來源巨噬細胞分離培養體系，并鑒定其吞噬淋巴瘤細胞的功能，為免疫細胞的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 IMDM、胎牛血清、人AB血清和TrypLE購自 Life Technology公司;人 M-CSF購自eBiosciences公司;Primocin購自 Invivogen公司;人CD14正選試劑盒和人CD14抗體(clone MoP9，APC標記)以及EasySep專用磁極購自Stemcell Technologies公司。

1.2 免疫磁珠法分離單核細胞 采集健康成人新鮮外周抗凝血，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，用洗液(含2%FBS的PBS)洗滌，懸浮細胞并計數，PBMC可放在液氮長期保存，解凍后的PBMC可用DNaseⅠ室溫孵育15 min后用30 μm的尼龍網過濾后重新計數，2.0×108個PBMC用來CD14正選，加入200 μl EasySep抗體正選試劑盒，用移液器輕輕上下吹打均勻，室溫孵育15 min，再加100 μl EasySep納米磁珠，充分混勻后室溫孵育10 min，輕輕混勻后將試管放入專用磁極中靜止5 min，將磁極連試管一起拿起，倒出上清部分。用洗液重新混勻后重復2次過程。

1.3 流式細胞術分析單核細胞分離純度 分別取分選前的PBMC、分選所得的CD14+單核細胞以及分流柱流出的細胞各5 ×105個細胞，加入2.5 μl人CD14-APC抗體(clone MoP9)，用抗鼠IgG單克隆抗體做同型對照，4℃避光孵育30 min，洗滌后用洗液懸浮細胞，流式細胞儀檢測分選前后細胞CD14的表達情況，以同型對照的細胞作為對照，計算細胞的CD14陽性率。

1.4 巨噬細胞的培養與形態學觀察 配置含10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養液，加入8 ml新鮮培養液于10 cm的細胞培養皿中，每個培養皿中CD14+單核細胞數為5×106個細胞，于37℃、5%CO2培養箱中培養7 d，培養期間不換液。在第1、3、6天時倒置顯微鏡觀察細胞的活力及形態，包括貼壁狀態，體積、形態、偽足的變化。

1.5 吞噬Raji細胞實驗

1.5.1 CFSE標記淋巴瘤Raji細胞 1.0×106個淋巴瘤Raji細胞懸浮于0.5 μmol/L CFSE熒光染料(PBS稀釋)中，室溫避光孵育2 min，立即加入FBS使FBS的含量為10%，37℃避光水浴10 min，離心洗滌后懸浮細胞，制備成CFSE標記淋巴瘤Raji細胞。

1.5.2 吞噬功能檢測 巨噬細胞培養到第7天時，PBS洗滌，用TrypLE消化15～20 min，收集巨噬細胞，用培養液調整巨噬細胞濃度至1.0×106個/ml，作為效應細胞。調整CFSE標記的Raji細胞濃度調整至2.0×106個/ml，作為靶細胞。各取50 μl效應細胞和靶細胞(效靶比為1∶2)加至96孔板，離心后于37℃、5%CO2培養箱中培養2 h，洗滌后懸浮細胞，每孔加人1 μl抗CD14-APC抗體，4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測吞噬率。

2 結果

2.1 單核細胞分離及純度鑒定 流式細胞儀檢測結果顯示(圖1)，免疫磁珠分選前CD14陽性細胞占PBMC的10%，分選后收獲的CD14陽性細胞群中CD14陽性率為85.8%，而CD14陰性細胞群中CD14陽性率為0.3%。表明采用免疫磁珠陽性分選可以獲得高純度的CD14+細胞。

2.2 CD14+單核細胞向巨噬細胞分化 CD14+細胞在10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養液中培養7 d，期間無需更換培養液，顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養24 h后，大部分細胞已經貼壁，細胞體積仍然較小，少量細胞伸出很短的偽足(圖2A)。培養到第3天時，細胞體積增大，偽足伸展明顯(圖2B)。培養到第6天時，偽足沒有進一步增加和伸展，細胞貼壁牢固，體積進一步明顯增大，較大的細胞直徑可達40～45 μm，形狀從不規則形逐漸變成橢圓形，大部分細胞呈煎蛋狀，少數為長梭形，培養液中懸浮的細胞與第三天時相比無明顯區別(圖2C)。

圖1 CD14陽性細胞純度流式檢測結果峰圖Fig.1 Flow cytometry graph of purity analysis of CD14 positive cellsN

圖2 巨噬細胞形態特征Fig.2 Morphological features of macrophages

圖3 巨噬細胞吞噬功能流式檢測結果峰圖Fig.3 Flow cytometry graph of phagocytosis function of macrophage

2.3 巨噬細胞吞噬功能 巨噬細胞培養到第7天時，流式細胞儀檢測CD14陽性率，CD14+細胞在數量上有部分減少，陽性率為46%。根據細胞的形態[5]及貼壁生長的特性[6]，此時培養板中生長的絕大多數是巨噬細胞。效應細胞(巨噬細胞)和靶細胞(CFSE標記的淋巴瘤Raji細胞)混合培養2 h后，用CD14-APC對巨噬細胞進行染色，流式細胞儀檢測吞噬率(圖3)。結果表明，巨噬細胞與淋巴瘤細胞作用后，82%巨噬細胞(包括CD14陽性和陰性)吞噬了淋巴瘤細胞，83%的CD14+巨噬細胞吞噬了Raji細胞，表明培養的巨噬細胞有很強的吞噬功能。

3 討論

單核-巨噬細胞是調節免疫應答的主要細胞，具有吞噬和殺傷、遞呈抗原和啟動免疫應答以及抗腫瘤等功能[2]。研究者可以從外周血中分離單核細胞，誘導成巨噬細胞進行功能研究[3]。免疫磁珠法是近年來細胞分選的重要技術，具有磁性的微顆粒通過結合特定抗體，在液相中能特異性地與相應抗原相結合，依靠磁場的作用力快速地使所需樣品得到大大的濃縮[7]。CD14為單核巨噬細胞系統特征性的表面標記，本實驗通過人CD14正選試劑盒，應用免疫磁珠法分離單核細胞，CD14陽性細胞率從分選前的10%提高到85.8%，得到了高純度的單核細胞。在人CD14正選試劑盒中，抗CD14抗體克隆號為BA-8，免疫磁珠分選后，一些抗原位點已被抗體封閉，所以在進行流式儀檢測CD14+細胞純度時，選用了克隆號為MoP9的抗CD14抗體，結果可以看出，該克隆抗體能跟CD14抗原的其他位點結合，較好地反映出細胞表面CD14抗原的表達量。

體外培養的單核細胞具有很強的可塑性，在GM-CSF、IL-4以及肝素刺激下，單核細胞可向樹突狀細胞分化[8]，在M-CSF刺激下可誘導單核細胞向巨噬細胞分化[2]，原因是M-CSF可誘導細胞產生活性氧(ROS)，進而導致磷酸酶SHP1氧化，氧化的磷酸酶可通過PI3K/AKT信號轉導通路促進單核/巨噬細胞的增殖分化[9]。加上含有高濃度同源血清來替代胎牛血清的培養體系則可以成功培養出巨噬細胞[10]。基于這些因素，本實驗用10%人AB血清來替代胎牛血清，再加上10 ng/ml M-CSF刺激，成功培養了大量巨噬細胞。細胞培養到第7天時，巨噬細胞牢固貼壁在培養板上，而一些未分化的單核細胞及樹突狀細胞將脫壁懸浮生長[6]，有利于巨噬細胞的進一步純化。

CD14+細胞經體外培養7 d后，收集巨噬細胞，本實驗用TrypLE來替代Trypsin消化15～20 min，TrypLE對細胞損傷小，無需Trypsin抑制劑，更有利于下一步巨噬細胞的功能檢測。用流式細胞儀檢測巨噬細胞培養第7天時CD14陽性率，表明CD14陽性率依然很高，但也有一大部分細胞不表達CD14分子。從顯微鏡觀察細胞形態來看，絕大部分細胞呈現巨噬細胞形態，與文獻報道的形態相一致[5]。Erbel等[4]也研究表明，單核細胞源巨噬細胞培養后CD14分子下調，而白細胞分子CD45RO保持不變。巨噬細胞的吞噬活性是巨噬細胞的重要功能特性，也是巨噬細胞發揮抗腫瘤作用的重要途徑。本研究對培養分化得到的巨噬細胞進行吞噬淋巴瘤Raji細胞實驗，表明體外培養的巨噬細胞吞噬Raji細胞的功能強，83%的CD14+巨噬細胞吞噬了Raji細胞。但在組織微環境中，由于巨噬細胞受到其他細胞分泌因子的刺激等眾多因素的影響，其功能也發生相應變化[11]。體外檢測巨噬細胞吞噬Raji細胞的實驗方法建立也有助于藥物開發，研究人員認為CD47抗體是一種新型抗淋巴瘤藥物，巨噬細胞表達Fc受體，識別包被于淋巴瘤細胞上的CD47抗體Fc段，加強了巨噬細胞吞噬淋巴瘤細胞功能[12]。本文從外周血中分離了高純度的CD14+單核細胞，誘導形成的巨噬細胞具有很好的吞噬淋巴瘤細胞的功能，為進一步研究巨噬細胞生物學作用、新型抗癌藥物開發創造了條件。

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[收稿2014-08-20 修回2014-09-10]
(編輯 倪 鵬)

Culture and functional identification of macrophages from human peripheral blood

LIN Wei-Ming，DAI Ai-Ling，Yin Hui-Fang，YANG Xiao-Yan.College of Life Sciences of Longyan University，Longyan 364000，China

Objective:To isolate monocytes from human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)，induce macrophages，and identify the function of macrophages.MethodsMonocytes were isolated from PBMC using magnetic activated cell sorting(MACS)anti-CD14 microbead.Sorted CD14+and CD14－cells were checked by flow cytometer to evaluate the efficiency of sorting.The sorted CD14+cells were cultured in IMDM media with 10%human AB serum and 10 ng/ml M-CSF for 7 days to generate macrophages，which were identified by morphological features and phagocytosis function.ResultsA high purity of monocytes was obtained by MACS anti-CD14 microbead.The percentage of CD14+cells was 10%and 85.8%before and after sorting，respectively.The macrophages were approximately 40-45 μm in maximum diameter and had the fried egg colony morphological features after 7 days culture.The lymphoma (Raji)cells were efficiently engulfed by macrophages.ConclusionThe high purity of CD14+monocytes is isolated from PBMC and monocyte-derived macrophages efficiently engulfed lymphoma cells.

Macrophages;Magnetic activated cell sorting;Culture;Functional identification

R292.12

A

1000-484X(2015)01-0086-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2015.01.018

①本文受福建省教育廳JK類項目(No.JK2011053)、福建省科技計劃重點項目(2013N0026)資助。

②福建省預防獸醫學與生物技術高校重點實驗室(龍巖學院)，龍巖364000。

林煒明(1976年－)，男，博士，副教授，主要從事動物免疫學方面研究，E-mail:wmlin925@126.com。

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