FAK及pAKT在乳腺癌中的表達及預后分析

徐璐，石晶，張凌云，時莎，曲晶磊，李智，侯科佐，曲秀娟，滕月娥

（中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽 110001）

·論著·

FAK及pAKT在乳腺癌中的表達及預后分析

徐璐，石晶，張凌云，時莎，曲晶磊，李智，侯科佐，曲秀娟，滕月娥

（中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，沈陽 110001）

目的探討黏著斑激酶（FAK）及磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）在乳腺癌組織中的表達情況及臨床價值。方法收集從1997至2008年于我院行乳腺癌根治手術的271例有完整存檔蠟塊標本，采用組織微陣列芯片和免疫組化SP法檢測FAK和p-AKT在乳腺癌組織中的表達，并對兩者的表達情況及其與乳腺癌臨床病理因素和患者生存情況的關系進行分析。結果FAK、p-AKT的高表達率分別為53.9%（146/271）、36.2%（98/271），兩者的表達水平呈正相關（r=0.397，P＜0.01）。FAK/pAKT同時均高表達的比率為29.2%（79/271）。FAK高表達與孕激素受體（PR）呈負相關（P=0.046），pAKT高表達與組織學分級（P=0.024）、淋巴結轉移（P=0.016）呈正相關，FAK與pAKT共同高表達的患者更傾向于出現淋巴結轉移、骨/軟組織轉移（P=0.019，P=0.022）。FAK高表達人群中，p-AKT高表達者的總生存期（OS）明顯短于低表達者（P=0.047）。單獨分析FAK及p-AKT表達與總體人群預后無關，將兩者聯合分析后，FAK/pAKT均高表達患者的OS明顯縮短（P=0.027）。亞組分析顯示：HER2陽性患者，FAK/pAKT高表達者的OS縮短（P=0.015），FAK/pAKT高表達是HER2陽性乳腺癌的獨立預后因素（HR= 3.352，P=0.021）。結論在乳腺癌組織中FAK和p-AKT兩者密切相關，FAK/pAKT聯合檢測能夠預測乳腺癌患者的預后，并能夠成為HER2陽性乳腺癌的獨立預后指標。

乳腺癌；黏著斑激酶；磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；預后

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。世界衛生組織公布的數據表明，在2012年乳腺癌已造成522 000人死亡［1］。隨著對乳腺癌基因表達譜認識的逐漸深入，乳腺癌患者的個體化治療和預后預測也在不斷完善［2］。目前除ER、PR、HER-2、Ki67等指標外，尚未發現其他更好指標能夠預測乳腺癌患者的預后，所以探索新的乳腺癌分子標志物將有助于更深入的解釋乳腺癌的臨床生物學行為并為其治療提供新的靶點。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是蛋白質分子量為125 kDa的非受體酪氨酸激酶，是整合素重要的下游信號分子［3，4］，參與包括細胞增殖、侵襲轉移、血管生成、上皮細胞間充質轉化等幾乎所有與腫瘤發生發展相關的過程［5］。目前的研究發現，FAK在大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌等多種腫瘤組織中蛋白水平或RNA水平處于高表達狀態，通過抑制其表達或功能可抑制腫瘤的惡性表型［6］。既往研究對FAK蛋白的表達是否能夠預測乳腺癌患者預后結論不一，目前FAK蛋白表達還不能作為一個成熟的生物學指標預測乳腺癌患者的預后。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）是FAK的下游信號通路，共同參與腫瘤發生發展和侵襲轉移的調控［7］，但目前FAK和其下游的pAKT在乳腺癌中聯合表達的意義和預后價值尚不清楚。本研究利用免疫組織化學方法檢測FAK聯合pAKT在271例乳腺癌組織中的表達，并分析其與乳腺癌臨床病理因素及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：收集1997至2008年期間于中國醫科大學附屬第一醫院行乳腺癌根治手術且有完整存檔的蠟塊標本271例，委托上海芯超生物科技有限公司制備組織微陣列芯片。所有病例術后病理學診斷均為浸潤性導管癌。入選病例均為女性，年齡26～76歲。所有患者術前均未接受任何化療和放療，且術后均在腫瘤內科接受蒽環或紫杉類藥物輔助化療，激素受體陽性患者接受輔助內分泌治療，T2～T3/N1～N2行輔助放療，無應用曲妥珠單抗輔助治療的患者。所有患者隨訪資料完整。依據美國癌癥聯合委員會（AJCC）2007年標準進行TNM分期，Ⅰ期患者52例（19.2%），Ⅱ期患者157例（57.9%），Ⅲ期患者61例（22.9%）。隨訪時間截止至2014年8月31日。從手術日期至復發轉移日期或末次隨訪截止日期定義為患者的無進展生存期（progression free survival，DFS），從病理診斷乳腺癌日期至死亡日期或末次隨訪截止日期定義為患者的總生存期（overall survival，OS）。全部患者的DFS為6.6～169.4個月，OS為11.7～175.5個月，中位隨訪時間為99.1個月。

1.1.2 主要試劑：兔抗人FAK及p-AKT多克隆抗體（工作濃度分別為1∶200和1∶250）購自SANTA CRUZ公司；免疫組化SP試劑盒、DAB試劑盒及檸檬酸修復液（100倍）、生物素標記的羊抗鼠/兔IgG（二抗）均購自福州邁新生物技術開發有限公司；蒸餾水、無水乙醇、二甲苯、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液、蘇木素、中性樹脂等均為國產試劑。

1.2 方法

采用SP免疫組化法。實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。用已知陽性對照片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

結果判定：FAK和pAKT均以胞膜和（或）胞質見淺黃色至棕褐色顆粒為陽性染色。結果判定采用雙盲法，由2位病理科醫師對染色結果復閱核定。依照陽性細胞比例評分：1分，1%～≤10%；2分，＞10%～≤33%；3，＞33%～≤66%；4分，＞66%～≤100%。依照顯色強度評分：未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別判定為0、1、2、3分。將2項得分相加，得到最終得分，0～3分為低表達，4～7分為高表達。

1.3 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。不同組間比較用χ2檢驗及Fisher確切概率法，生存率的比較采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，采用Cox比例風險回歸分析進行預后因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FAK和pAKT在浸潤性乳腺癌組織中的表達

免疫組化染色結果顯示：271例乳腺癌組織中，FAK蛋白的高表達率為53.9%（146/271），pAKT的高表達率為36.2%（98/271），兩者的表達呈正相關（r=0.397，P＜0.01），FAK和pAKT均高表達的比率為29.2%（79/271）。見圖1、2。

2.2 FAK與pAKT聯合檢測分析及其與乳腺癌臨床病理因素的關系

FAK蛋白表達與孕激素受體（progesterone receptor，PR）呈負相關（P=0.046），與患者的年齡、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期、雌激素受體（estrogen receptor，ER）狀態、HER-2狀態無顯著相關（表l）。pAKT高表達與組織學分級（P= 0.024）、淋巴結轉移呈正相關（P=0.016），與其他指標無顯著相關（表l）。FAK與pAKT共同高表達的患者更傾向于出現淋巴結轉移、骨/軟組織轉移（P= 0.019，P=0.022）。

2.3 FAK及pAKT表達與乳腺癌預后的關系

圖1 免疫組化方法檢測乳腺癌中FAK蛋白的表達 ×400Fig.1 Immunohistochemistry staining of FAK protein in breast cancer×400

圖2 免疫組化方法檢測乳腺癌中pAKT蛋白的表達 ×400Fig.2 Immunohistochemistry staining of pAKT protein in breast cancer×400

在271例乳腺癌患者中，刪除術后輔助化療未滿4個周期的患者，剩余221例患者進行生存分析。Kaplan-Meier法的分析結果顯示，FAK蛋白表達與乳腺癌患者預后的DFS（P=0.569）及OS（P= 0.366）無關。FAK高表達患者，pAKT高表達者生存期明顯短于低表達者（P=0.047），見圖3。FAK/ pAKT均高表達者OS顯著縮短（P=0.027），見圖4。HER-2陽性亞組分析中，FAK/pAKT高表達者的OS縮短（P=0.015），見圖5。

2.4 乳腺癌復發及死亡的單因素及多因素分析

2.4.1 乳腺癌復發的單因素及多因素分析：對乳腺癌患者復發的Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，對患者復發有顯著影響的因素為TNM分期（P＜0.01）、淋巴結轉移（P=0.007）、HER-2狀態（P= 0.017），而診斷時年齡、腫瘤大小、病理組織學分級、HR狀態、FAK、pAKT、FAK與pAKT聯合表達對乳腺癌的復發均無顯著影響。將單因素分析篩選出的因子納入多因素COX風險模型中，發現只有TNM分期能夠成為影響乳腺癌復發的獨立危險預后因素（P=0.003，表2）。

表1 FAK和pAKT蛋白表達與乳腺癌臨床病理因素的相關性分析Tab.1 Relationship between the expression of FAK and pAKT protein and clinical pathology of breast cancer

圖3 FAK蛋白高表達患者pAKT表達的DFS和OS曲線Fig.3 DFS and OS curves of FAK positive breast cancer patients with pAKT expression

圖4 FAK和pAKT蛋白聯合表達的DFS和OS曲線Fig.4 DFS and OS curves of breast cancer patients with co-expression of FAK and pAKT

圖5 HER2陽性亞組FAK和pAKT蛋白聯合表達的DFS和OS曲線Fig.5 DFS and OS curves of HER2 positive breast cancer patients with co-expression of FAK and pAKT

2.4.2 乳腺癌死亡的單因素及多因素分析：單因素生存分析結果顯示，對患者死亡有顯著影響的因素為診斷時年齡（P=0.001）、TNM分期（P＜0.01）、淋巴結轉移（P=0.004）、HER-2狀態（P=0.006）、FAK與pAKT聯合表達（P=0.027），而腫瘤大小、病理組織學分級、HR狀態、FAK、pAKT、對乳腺癌的死亡均無顯著影響。將單因素分析篩選后納入多因素COX風險模型中，發現發病年齡（P=0.001）、TNM分期（P=0.007）能夠成為影響乳腺癌死亡的獨立危險預后因素（表2）。

2.4.3 HER2亞組的乳腺癌復發及死亡的單因素及多因素分析：在HER2陽性亞組患者中，單因素分析顯示診斷時年齡（P=0.012）、TNM分期（P=0.048）顯著影響患者的DFS，且診斷時年齡（P=0.003）、TNM分期（P=0.017）是影響HER2陽性乳腺癌患者復發的獨立危險預后因素。而診斷時年齡（P＜0.01）、FAK聯合pAKT表達（P=0.016）顯著影響患者的OS，且診斷時年齡（P=0.002）、FAK聯合pAKT（P=0.021）是HER2陽性亞組總生存的獨立危險預后因素（表3）。

表2 乳腺癌復發及死亡的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of breast cancer for recurrence and mortality

3 討論

聚集于細胞膜表面的FAK的活化是胞外信號向胞內傳導的重要環節，參與包括整合素、生長因子受體和細胞因子受體等一系列細胞表面受體的下游信號傳導［6］，并在細胞的黏附、遷移、侵襲、轉移、上皮-間質細胞轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）及血管生成方面發揮重要作用［8，9］。相比于正常乳腺組織，乳腺癌組織中FAK蛋白和mRNA均呈高表達，且與乳腺癌細胞高組織學分級、低分化、激素受體陰性及高Ki67指數等不良預后因素密切相關［10～13］。體外實驗結果表明，抑制FAK的活性可以顯著降低乳腺癌細胞侵襲和轉移的能力［14，15］。但目前仍缺少充分的臨床證據明確FAK蛋白表達與乳腺癌生存之間的關系。本研究結果顯示，FAK蛋白表達不能影響患者預后，與既往的研究結論一致，但基礎研究發現，激活FAK會加速細胞的惡性轉化而非增強細胞的侵襲能力［16］，因此有必要進一步研究FAK與乳腺癌之間的關系。

表3 HER2陽性乳腺癌復發及死亡的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors for the HER positive breast cancer patients

PI3K/AKT作為FAK的下游信號通路，參與調控腫瘤發生發展和侵襲轉移［7］。Schmitz等［11］發現，在162例淋巴結陰性的乳腺癌患者中，FAK的高表達與pAKT呈正相關，這與本研究結果相一致，為FAK與pAkt的聯合檢測提供了依據。本研究結果還發現，雖然FAK和pAKT高表達與臨床分期、組織分級、淋巴結轉移及激素受體狀態等臨床特征均不相關，但FAK與pAKT共同高表達的患者更傾向于出現淋巴結轉移、骨/軟組織轉移，并且OS顯著縮短，提示FAK與AKT在促進腫瘤侵襲轉移方面發揮協同作用，具有二者共同高表達的乳腺癌患者預后不良。既往研究證實，FAK在HER2信號傳導通路中發揮重要的作用［17］，并可能與乳腺癌的曲妥珠單抗耐藥相關［18，19］，抑制FAK的活性，能夠增加乳腺癌細胞系ER+/HER2+（BT-474 and MDAMB361）對曲妥珠單抗的敏感性［14］，說明FAK與HER2介導的乳腺癌密切相關。進一步在HER2陽性患者中進行生存分析，結果發現FAK/pAKT均高表達患者OS明顯縮短，并與診斷時年齡共同成為HER2陽性亞組總生存的獨立危險預后因素，進一步從臨床上證實HER2可能是通過FAK/PI3K/AKT通路影響乳腺癌患者預后。雖然本研究為回顧性研究，具有一定的局限性，同時，組織芯片不能代表整個組織表達情況，可能因為腫瘤異質性等原因存在誤差，但本研究結果提示這2種蛋白的共同高表達，而非單獨FAK蛋白高表達，可能在未來成為判定乳腺癌不良預后的重要指標，二者的聯合檢測對預測乳腺癌患者的生存更有價值。阻斷FAK和AKT的相互作用也可以成為預防乳腺癌轉移的新靶點，為HER2陽性乳腺癌患者的治療提供新的手段。

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（編輯 王又冬）

Expression and ClinicalSignificance of FAKCombined with pAKTin BreastCancer

XULu，SHIJing，ZHANGLing-yun，SHISha，QUJing-lei，LIZhi，HOU Ke-zuo，QUXiu-juan，TENG Yue-e

（DepartmentofOncology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

Objective To explore the expression prognostic value of FAK combined with pAKT in breast cancer patients.MethodsData from a cohortof271 invasive breastcancerpatients underwentradicaloperation in The FirstHospital，China MedicalUniversity from 1997 to 2008，wascollected.FAK and pAKTwas validated by IHCin tissue microarrays and statistically assessed forrelationship with clinicopathologicalfactorsand prognosis.ResultsThe high expression rate ofFAK was 53.9%（146/271），and pAKTwas 36.2%（98/271）in breastcancertissues.There was positive correlation between FAK and pAKT（r=0.397，P＜0.01）.High expression of FAK was related to PR state（P=0.046），high expression of pAKT was related to histological grade（P=0.024）and lymph node metastasis（P=0.016），and high co-expression of FAK and pAKT was related to lymph node metastasis（P=0.019）and bone/soft tissue metastasis（P=0.022）.High expression of FAK，lower expression of pAKT has better prognosis than its higher expression.There was no significant difference of the disease-free survival（DFS）or overall survival（OS）between breast cancer patients with/without FAK or pAKT expression.High expression of FAK/pAKT showed worse OS（P=0.027）in whole patient.HER2 positive subgroup analysis showed thatFAK/pAKTnegative patients hassignificantly betterOS than positive group（P=0.015），and multivariate Cox proportional hazard regression analysis showed that FAK/pAKT is mortality of independent prognostic factor（HR=3.352，P=0.021）.ConclusionThere was closely relationship between FAK and pAKT.High co-expression of FAK and pAKT can predict OS of breast cancer patients，which can be used as the mortality ofindependentprognostic factorofHER2 positive breastcancerpatients.

breast cancer；FAK；p-AKT；prognosis

R737.9

A

0258-4646（2015）08-0673-06

國家自然科學基金（81172535）

徐璐（1985-），女，醫師，博士研究生.

滕月娥，E-mail：tengyuee0517@163.com

2015-06-04

網絡出版時間：