PJ34對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達的影響

吳捧蓮，李巖，付新慧，杜良鶴，王東玉

（1.遼寧醫學院研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫院神經內科，遼寧 錦州 121000）

·論著·

PJ34對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦組織MMP-9、Claudin-5表達的影響

吳捧蓮1，李巖2，付新慧1，杜良鶴1，王東玉2

（1.遼寧醫學院研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省錦州市中心醫院神經內科，遼寧 錦州 121000）

目的探討多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）抑制劑PJ34對大鼠局灶性腦缺血再灌注后缺血側皮層金屬蛋白酶9（MMP-9）和Claudin-5表達的影響。方法采用線栓法制備大鼠局灶腦缺血再灌注模型，腹腔注射PJ34，用伊文思藍（EB）法檢測血腦屏障通透性變化，采用2，3，5-三氨基苯甲四氮唑（TTC）染色檢測腦梗死體積變化，免疫組化和Western blot方法檢測腦缺血側皮層MMP-9和Claudin-5表達。結果與假手術組比較，隨缺血再灌注時間延長，模型組MMP-9表達、EB含量、腦梗死體積逐漸增加，48 h達峰；Claudin-5的表達、EB含量、腦梗死體積逐漸減少，48 h最低（P均＜0.05）。與模型組比較，PJ34組MMP-9表達、EB含量、腦梗死體積在各個時間點明顯降低，Claudin-5的表達、EB含量、腦梗死體積在各個時間點明顯增高（P均＜0.05）。結論PJ34通過抑制MMP-9的表達，增加Claudin-5的表達來維持血腦屏障通透性，對腦缺血再灌注損傷有神經保護作用。

PJ34；金屬蛋白酶9；Claudin-5；血腦屏障；缺血再灌注

PARP-1的抑制劑PJ34［N-（6-氧代-5，6二氫-菲-2-基）-N，N-二甲基乙酰胺］，為水溶性菲啶酮類化合物，主要通過競爭性阻斷多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）分子上NAD+結合位點發揮作用，在缺血再灌注損傷和帕金森病、癌癥的動物模型中取得較好治療效果［1］。PJ34對缺血再灌注損傷血腦屏障通透性的研究機制尚未完全清楚。近年研究表明金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可以降解基底膜蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白和緊密連接蛋白（Claudin-5和occludin），破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性。

本實驗研究建立在上述研究的基礎上，采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，選用PJ34作為干預因素，觀察PJ34對大鼠局灶腦缺血再灌注BBB通透性變化、缺血側腦組織MMP-9、Claudin-5蛋白表達的影響，探討PJ34減輕腦缺血再灌注損傷的機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠120只，體質量250～300 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供（動物許可證號：SCXK［遼］2010-0001）。隨機均分為3組：假手術組、模型組、PJ34組。各組分別在缺血再灌注24 h、48 h取材。PJ34組在缺血再灌注時及再灌注后2 h分別給予PJ34（10 mg/kg），假手術組、模型組在相同時間點給予等量生理鹽水。PJ34購自Selleck.cn公司；兔抗鼠MMP-9多克隆抗體、生物素標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Claudin-5多克隆抗體購自北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 大鼠局灶性大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制備

參照Longa等［2］的實驗方法，制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型。采用直徑2 mm的魚線，長約5.8 cm，一端用酒精燈稍加熱使魚線頭部直徑約為0.25～0.28 mm，備用。大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，固定，消毒，頸部正中切口，分離頸總動脈和頸內、外動脈，勿損傷迷走神經，于頸總動脈近心端、頸外動脈根部結扎，在頸總動脈分叉近心端處剪一小口，插入魚線，進線（1.8±0.5）cm，感到有阻力時，即栓線到達大腦中動脈起始處及大腦前動脈近心端，從而阻斷大腦中動脈血流，結扎固定魚線?？p合筋膜、皮膚。栓塞2 h后使血流再通。假手術組手術過程與模型組相同，不插魚線。大鼠麻醉后約2 h開始蘇醒，于再灌注時判斷其神經功能缺損情況，按照longa評分法［3］進行評分。評分1～3分納入實驗動物，0分、4分剔除，符合評分但有蛛網膜下腔出血、術后死亡作為缺失值剔除，在后續實驗中補足，術后保持環境溫度25～30℃。

1.3 伊文思藍（Evans blue，EB）BBB通透性測定

每亞組隨機抽取5只大鼠，在取腦前30 min經尾靜脈注射2%EB。麻醉后用肝素化生理鹽水心臟灌流至右心房流出液體為清亮。各個時間點取腦組織，稱重，置于甲酰胺中（100 mg/mL），45℃水浴24 h，離心取上清液。分光光度計波長為620 mm測定上清液吸光度（optical density，OD）值，腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量（μg/g）=待測樣品EB含量（μg/mL）×甲酰胺溶液（mL）/腦濕重（g），待測樣品EB含量是根據標準曲線回歸方程求得。

1.4 腦梗死體積測定（TTC染色法）

每亞組隨機抽取5只大鼠，斷頭取腦，快速經枕骨大孔取出腦組織，洗凈腦組織，-20℃冰箱速凍30 min。腦組織從額極向后以2 mm間距冠狀切成5片。腦片置于37℃水浴箱避光染色15～30 min，注意中間翻片使切片均勻接觸染色液，10%多聚甲醛中固定。鼠腦切片用數碼相機拍照，用眼科鑷分離白色區與紅色區，分別稱重，以梗死組織重量占缺血側腦組織重量的百分比作為梗死體積的判定標準。

1.5 免疫組化染色檢測MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達

每亞組隨機抽取5只大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，快速打開胸腔，經左心室穿刺插管入主動脈，灌注4℃生理鹽水250 mL，同時剪開右心耳，4%多聚甲醛250 mL緩慢灌注至液體清亮斷頭取腦，固定液中保存。常規脫水、浸蠟、包埋，連續冠狀切片，操作按試劑盒說明書進行MMP-9、Claudin-5免疫組化染色。切片染色后每個樣本選取5張切片，每張切片于400倍光鏡下系統隨機選取3個視野進行檢測，計算平均積分光密度值（mean oprieal density，MOD）。圖像分析MMP-9、Claudin-5在腦組織額頂葉皮層的表達，用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統對免疫組化結果進行圖像分析。

1.6 Western blot檢測MMP-9、Claudin-5在腦組織的表達

每亞組隨機抽取5只大鼠，斷頭取腦，冰上迅速分離額頂葉皮層，放入EP管中，-80℃冰箱保存。組織標本加入適量裂解液，進行超聲波粉碎，低溫離心取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度定量，沸水煮5 min，離心備用。制備分離膠和濃縮膠，加樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，加一抗：兔抗大鼠多克隆MMP-9抗體（1∶300）和Claudin-5（1∶300）4℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min× 3次，加二抗（山羊抗兔IgG，1∶3 000）孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL發光，X線曝光、顯影、定影，計算機圖像分析。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 PJ34對血腦屏障通透性的影響

用EB法檢測血腦屏障通透性，EB含量變化來評價血腦屏障通透性變化。與假手術組比較，模型組與PJ34組均明顯增高（P＜0.05），EB含量在再灌注后48 h達峰。與模型組比較，PJ34組能降低血腦屏障的破壞，使EB含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PJ34對大鼠EB含量的影響（μg/g濕重）Tab.1 Influence of PJ34 on EB content in rats（μ g/g wet weight）

2.2 梗死體積百分比測定

用TTC染色法檢測腦梗死體積。與假手術組比較，模型組與PJ34組均明顯增高（P＜0.05），腦梗死體積在再灌注后48 h達峰。與模型組比較，PJ34組腦梗死體積明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 大鼠腦梗死體積百分比比較（%）Tab.2 Comparison of the percentage of infarct volume in rats（%）

2.3 MMP-9和Claudin-5的分布和表達

免疫組化結果顯示，MMP-9在缺血側額頂葉皮層胞質中呈棕褐色或棕黃色陽性表達。與假手術組比較，模型組、PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后24 h增加，48 h達高峰，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，PJ34組MMP-9的MOD值在再灌注后減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖1。Claudin-5在缺血側額頂葉皮層中沿微血管內皮細胞呈棕褐色或棕黃色表達。與假手術組比較，模型組和PJ34組Claudin-5在再灌注后24 h MOD值降低，48 h MOD值降低最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，PJ34組Claudin-5在再灌注后MOD值均高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖2。

圖1 免疫組化法檢測大鼠缺血側皮層MMP-9的表達 ×400Fig.1 Expressions of MMP-9 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic cerebral cortex of rats×400

表3 各組大鼠不同時間點免疫組化法檢測MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白的MOD值比較Tab.3 Comparison of the MOD values of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Immunohistochemistry

圖2 免疫組化法檢測缺血側微血管內皮細胞中Claudin-5的表達 ×400Fig.2 Expressions of claudin-5 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic brain microvessel endothelial cells of rats ×400

2.4 Claudin-5和MMP-9蛋白的表達

采用Western blot法進一步證實假手術組、模型組和PJ34組中Claudin-5和MMP-9蛋白表達的影響。與假手術組比較，模型組出現MMP-9特異性條帶，24 h增高，48 h達峰；與模型組比較，PJ34組 MMP-9特異性條帶均減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組Claudin-5特異性條帶24 h降低，48 h降低最明顯；與模型組比較，PJ34組Claudin-5特異性條帶均增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4 各組大鼠不同時間點MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白相對含量的比較（%）Tab.4 Comparison of the relative content of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Western blot（%）

圖3 Western blot法檢測缺血側皮層MMP-9、Claudin-5的表達Fig.3 The expressions of MMP-9 and Claudin-5 were measured by Western blot analysis in the ischemic cerebral cortex of rats

3 討論

PARP-1抑制劑在心腦血管疾病、癌癥、內分泌疾病和炎癥中的作用已經成為全球研究和關注的熱點，但較少見其對血腦屏障通透性方面的研究報道。本實驗主要觀察了PARP-1抑制劑PJ34對MMP-9、Claudin-5在腦缺血再灌注損傷中表達的影響，旨在探討PJ34對血腦屏障通透性影響的研究機制。

PARP-1是一種DNA損傷效應酶，主要分布細胞核內，對DNA損傷修復起重要作用。當機體發生DNA損傷、氧化應激反應時，PARP-1被激活，應用PARP-1抑制劑PJ34，可以抑制PARP-1的表達，能充分恢復ATP水平，減少神經細胞死亡，對機體產生保護作用［4］。研究表明在大鼠局灶腦缺血再灌注損傷中，PJ34干預使腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達減少，降低TNF-α對MMP-9mRNA合成的誘導，從而降低MMP-9的表達［5，6］。Koh等［7］通過研究PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide，3-AB）的治療效果，PARP抑制劑3-AB治療組各時間點血漿及腦內MMP-9的水平、核轉錄因子kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）的活性顯著減少。TNF-α通過NF-kB基因的轉錄位點，誘導MMP-3的表達，MMP-3能激活MMP-9。本實驗研究結果與上述研究結果一致，在腦缺血再灌注損傷24 h時，MMP-9表達明顯升高，48 h時達高峰，PJ34干預腦缺血再灌注后，缺血側皮層MMP-9的活性降低、表達減少，梗死體積減少，神經缺損有所改善。

腦缺血再灌注后激活的膠質細胞、神經元及浸潤的中性粒細胞均能釋放MMP-9，MMP-9可以攻擊腦毛細血管基底膜和緊密連接（tight junction，TJ）蛋白，導致白細胞浸潤、血腦屏障開放、血管源性水腫、缺血后出血性轉化［8］。Claudin-5是構成TJ蛋白的骨架蛋白，是決定TJ蛋白屏障通透性的主要蛋白，維護大鼠的BBB完整性。TJ蛋白和細胞外基質構成腦和血液之間物質交換的第一道屏障，BBB是維持中樞神經系統內環境穩定的關鍵。因此，MMP-9可以降解Claudin-5蛋白。研究表明在大鼠缺血再灌注損傷模型組，MMP-9表達升高，Claudin-5表達減少，PARP抑制劑3-AB（10 mg/kg）治療組顯著上調Claudin-5的蛋白表達［9］。再灌注損傷中血腦屏障通透性破壞的一個重要機制是MMP-9降解Claudin-5［10，11］。本研究結果與上述研究結果相一致，應用PJ34干預后MMP-9表達減少，Claudin-5表達增加。MMP-9和Claudin-5在調節血腦屏障通透性和血管內皮細胞完整性中起重要作用［12］。大鼠腦缺血損傷后，MMP-9被激活，激活的MMP-9通過降解Claudin-5，增加血腦屏障通透性。應用MMP-9抑制劑后，Claudin-5表達下調，血腦屏障通透性減少［13］。MMP-9降解Claudin-5的機制可能為：缺血再灌注損傷使炎性因子增加，導致NF-kB磷酸化，NF-kB的激活能上調MMP-9的表達［14］。Claudin-5的降解和血腦屏障通透性增加是MMP-9通過NF-kB/MMP-9信號轉導通路來實現的。本研究也提示，在腦缺血再灌注后，MMP-9的表達下降可以增加Claudin-5的表達。

本研究采用大腦中動脈栓塞制備局灶腦缺血再灌注模型，在缺血再灌注后24 h，MMP-9的表達增加，Claudin-5的表達減少，血腦屏障通透性增加，梗死體積增加。在48 h時間點MMP-9的表達達峰，Claudin-5的表達最低，血腦屏障通透性達峰，腦梗死體積進一步增加，表明MMP-9參與血腦屏障的破壞，Claudin-5對血腦屏障有保護作用。應用PJ34干預后，MMP-9的表達減少，Claudin-5的表達增加，從而改善血腦屏障通透性，減少梗死體積，減少缺血再灌注后神經功能缺損。

綜上所述，PJ34通過降低MMP-9的表達，減少Claudin-5的降解，使Claudin-5的表達增加，改善血腦屏障通透性，對神經系統損傷產生保護作用。

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（編輯 武玉欣）

Influence of PJ34 on the Expression ofMMP-9 and Claudin-5 in Ratwith FocalCerebral Ischemia Reperfusion Injury

WUPeng-lian1，LIYan2，FUXin-hui1，DU Liang-he1，WANG Dong-yu2
（1.Graduate SchoolofLiaoning MedicalUniversity，Jinzhou 121001，China；2.DepartmentofNeurology，Jinzhou CentralHospital，Jinzhou 121000，China）

Objective To investigate the effectsofPJ34，a poly ADP-ribose polymerase（PARP）inhibitor，on the expression ofmatrix metalloproteinases-9（MMP-9）and Claudin-5 in ischemic cortex of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion（I/R）injury.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by intraluminal suture.PJ34 was injected intraperitoneally.Blood-brain barrier（BBB）permeability was quantitatively determined by Evansblue assay.Infarctvolume changes were observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloridedyeing（TTC）staining.The expression ofthe MMP-9 and Claudin-5 in rats ofcerebralcortex were measured by immunohistochemistry assay and Western blotanalysis.ResultsCompared with sham group，the expression ofMMP-9，the contents ofEB and infarctvolume increased progressively over time after I/R，and reached maximum levels at 48 h（P＜0.05）；The expression of Claudin-5，the contents of EB and infarct volume reduced significantly over time after I/R，and reached the minimum levels at 48 h in model group（P＜0.05）.Compared with model group，the expression of MMP-9，the contents of EB and infarct volume was reduced significantly and the expression of Claudin-5，the contents ofEB and infarctvolume was increased atthe same time pointin PJ34 group（P＜0.05）.ConclusionPJ34 maintained the blood-brain barrierpermeability by inhibiting the expression ofMMP-9，and increasing the expression ofClaudin-5，which had neuroprotection on cerebralischemiareperfusion injury.

PJ34；matrix metalloproteinases-9；Claudin-5；blood-brain barrier；ischemia-reperfusion

R743.3

A

0258-4646（2015）08-0694-05

遼寧省自然科學基金（201102074）

吳捧蓮（1988-），女，碩士研究生.

王東玉，E-mail：1448219167@qq.com

2015-02-24

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