SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態性與2型糖尿病易感性的相關性研究

劉陽，王占友，池志宏，王濤

（1.遼寧醫學院附屬第三醫院醫學檢驗中心，遼寧 錦州 121000；2.中國醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，沈陽 110001；3.東北大學生命健康科學學院神經科學研究所，沈陽 110015）

·論著·

SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態性與2型糖尿病易感性的相關性研究

劉陽1，2，王占友2，3，池志宏2，王濤3

（1.遼寧醫學院附屬第三醫院醫學檢驗中心，遼寧 錦州 121000；2.中國醫科大學基礎醫學院病理生理學教研室，沈陽 110001；3.東北大學生命健康科學學院神經科學研究所，沈陽 110015）

目的探討SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態性（SNP）與錦州地區2型糖尿病（T2DM）易感性之間的相關性。方法基于病例-對照分析，采用聚合酶鏈反應（PCR）-高分辨率溶解曲線（HRM）方法對錦州地區136例2型糖尿病患者（T2DM組）和145例健康對照（NC組）SLC30A8基因rs13266634位點的單核苷酸多態性進行檢測。結果CC基因型頻率T2DM組（38.23%）高于NC組（22.07%）；C等位基因頻率T2DM組（61.76%）高于NC組（51.03%），差異均具有統計學意義（P＜0.05）；等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病風險（OR=1.550，95%CI：1.108～2.169，P＜0.05）。結論SLC30A8基因rs13266634 C/T單核苷酸多態性與錦州地區T2DM的發病相關，C是風險等位基因。

SLC30A8基因；單核苷酸多態性；高分辨率溶解曲線；2型糖尿病

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）具有明顯的遺傳傾向，其遺傳度為31%～69%［1］，屬于復雜的多基因遺傳病。基于全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS），在法國人群中首次發現SLC30A8基因和2型糖尿病相關［2］。隨后，在不同種群開展了其重復研究與薈萃分析［3～6］，研究結果顯示，SLC30A8基因的rs13266634是與2型糖尿病最相關的遺傳易感位點。由于種族和地域的差異，所得研究結果也不盡相同［7］。因此，本文基于病例-對照研究，通過聚合酶鏈反應-高分辨率溶解曲線法［8］檢測SLC30A8基因rs13266634 C/T遺傳位點的單核苷酸多態性，旨在探討錦州地區人群中此位點的分布及對2型糖尿病的風險預測。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年12月至2014年12月遼寧醫學院附屬第三醫院門診就診的T2DM患者（T2DM組）136例，皆為北方地區漢族，并且彼此無任何親緣關系。男65例，女71例，平均年齡（51.42±10.23）歲；排除嚴重的心肝腎疾病患者，患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準。另外，選取同一時期門診就診的健康體檢正常人145例為正常對照（NC組），其中男69例，女76例，平均年齡（52.63±13.21）歲。2組在年齡和性別構成上差異均無統計學意義（P＞0.05）。均取得所有研究對象的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：基因組DNA提取試劑；2×PCR Reaction Mix（上海申能博彩生物科技有限公司）。SYTO?9 green fluorescent nucleic acid stain（InvitrogenTM-MolecularProbesTM，美國）；Rotor-Gene熒光定量PCR儀器（Corbett公司），凝膠圖像分析系統（上海天能科技有限公司），凝膠電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2.2 基因組DNA的提取：采用常規苯酚-氯仿法進行基因組DNA提取作為模板，并對DNA含量進行分析、測定，-80℃保存，備用。

1.2.3 引物設計：根據UCSC genome browser（http：// genome.ucsc.edu/）獲得所需 SLC30A8基因的rs13266634SNPs的資料，基于PRIMER5.0設計高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM）引物。引物設計原則確保擴增產物片段控制在50～200 bp。

1.2.4 PCR-HRM反應體系建立：根據文獻［8］，建立相應的PCR-HRM反應體系。PCR反應體系25 μL，2×PCR的反應MIX 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，5 μmol/L SYTO9熒光染料7.5 μL，DNA模板2 μL。PCR反應參數：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40循環，72℃終末延伸5 min。HRM反應參數：94℃變性1 min，40℃復性3 min，HRM 70～90℃，以0.05℃/s的斜率采集溶解曲線，在Rotor-Gene熒光定量PCR儀器基因掃描軟件模塊上進行分析。

1.2.5 HRM的基因分型：利用Tm溫度的差異，直接區分樣本對應的基因型純合子和雜合子；但不足以區分不同純合子之間Tm的差異［9］；采用參入法［10］進行區分不同純合子分型，即在純合子基因中摻入已知純合子基因型，若與已知純合子基因型相同表現為純合子型曲線，相反表現為雜合子曲線，以達到區分不同純合子基因型。

1.3 統計學處理

應用Haploview4.0軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。組間基因型及等位基因頻率的分布差異采用χ2檢驗；多態性位點與2型糖尿病易感性的分析采用比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（CI）表示。所有統計學分析均采用雙尾概率檢測，P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 SLC30A8基因型rs13266634 SNP的HRM基因分型結果

T2DM組模板DNA經PCR-HRM基因分型后得到3種基因型（雜合子型CT、純合子型CC、純合子型TT），見圖1～4。

圖1 SLC30A8-rs13266634-T2DM-HRMFig.1 SLC30A8 rs13266634-T2DM-HRM

圖2 SLC30A8-rs13266634-T2DM-雜合MeltFig.2 SLC30A8 rs13266634-T2DM-heterozygotic Melt

圖3 SLC30A8-rs13266634-T2DM-純合MeltFig.3 SLC30A8rs13266634-T2DM-homozygotic Melt

圖4 SLC30A8-rs13266634-T2DM-純合造雜合HRMFig.4 SLC30A8 rs13266634-T2DM-forged heterozygotic Melt

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

采用Hardy-Weinberg平衡法檢驗SLC30A8基因rs13266634 C/T多態性位點均無統計學差異（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，證明本研究人群已達到遺傳平衡，具有群體代表性。見表1。

2.3 rs13266634 C/T多態性位點基因型和等位基因型頻率分布比較

如表2所示，CC基因型頻率T2DM組高于NC組，且各基因型分布頻率在2組間存在統計學差異（χ2=8.838，P=0.012）。兩組C等位基因頻率比較，T2DM組高于NC組，并且各等位基因型分布頻率2組間存在統計學差異（χ2=6.566，P=0.010）。

表1 SLC30A8基因rs13266634 C/T多態性位點Hardy-Weinberg平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene

表2 SLC30A8基因rs13266634 C/T多態性位點基因型和等位基因型頻率分布比較［n（%）］Tab.2 Genotype and allele frequencies of the rs13266634 C/T locus in SLC30A8gene［n（%）］

2.4 SLC30A8 SNP位點基因型和等位基因與2型糖尿病發病風險的預測

SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態性遺傳位點的CC基因型與2型糖尿病的聯系強度OR值為1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05），意味著增加了2型糖尿病1.452倍患病風險。并且等位基因C與2型糖尿病的聯系強度OR值為1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），即增加了2型糖尿病1.550倍患病風險。

3 討論

本研究在錦州地區的人群中初步驗證了文獻報道的SLC30A8的rs13266634 C/T的單核苷酸多態性，并且證實了rs13266634與T2DM易患性相關。本研究結果顯示：不同于印度地區人群［7］，錦州地區T2DM組的rs13266634 C/T的CC基因型頻率和C等位基因頻率均高于NC組，這一結果與中國漢族人群相似［3］，說明存在地域和種族的差異。與此同時，等位基因C在兩組之間的分布存在統計學差異（P＜0.05），等位基因C增加了2型糖尿病1.550倍患病風險。

研究顯示，人類ZnT-8 DNA編碼序列被發現在AC027419重疊區，SLC30A8作為鋅轉運體家族的一員，可定位在人8q24.11染色體上。包含8個外顯子，全長37 kb，編碼368個氨基酸蛋白。特異性的在胰島β細胞高表達，位于胰島素分泌顆粒膜中，能夠促進鋅離子在胰島素分泌囊泡中聚集［11］，是參與胰島素儲存、合成、分泌的重要成分。定位于SLC30A8基因第8外顯子的rs13266634多態性屬于非同義突變，是由單個核苷酸改變引起的，即Arg325變異成Trp325（R325W）［7］。這一結果可能發生鋅離子與胰島素分子結合不穩，影響胰島素儲存、合成和分泌，導致胰島素功能改變，增加T2DM的發病概率［12］。而本研究的結果也證實了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態性位點與2型糖尿病易感性相關，統計分析顯示SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態性遺傳位點的CC基因型與2型糖尿病的聯系強度OR值為1.452（95%CI：1.150～1.833，P＜0.05）；并且等位基因C與2型糖尿病的聯系強度OR值為1.550（95%CI：1.108～2.169，P＜0.05），可以推測SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態性遺傳位點的CC基因型和等位基因C能夠增加2型糖尿病的患病風險。

由于本研究人群量和人群覆蓋地區有限，所得結果驗證了SLC30A8基因的rs13266634 C/T多態性位點在錦州地區人群中的存在；并且與2型糖尿病易感性相關。CC基因型及等位基因C是2型糖尿病的風險因素，但仍需擴大研究樣本進行進一步的驗證。盡管SLC30A8是目前2型糖尿病的GWAS研究中易感基因之一，但是其導致2型糖尿病發病的病理生理機制不明，進一步研究其機制對糖尿病的預防及治療具有重要的臨床意義。

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（編輯武玉欣）

Research on Correlation between rs13266634 C/TSNP of SLC30A8Gene and Susceptibility to
Type 2 Diabetes Mellitus

LIUYang1，2，WANG Zhan-you2，3，CHI Zhi-hong2，WANG Tao3

（1.Center of Medical Laboratory，The Third Hospital Affiliated to Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China；2.Department of Pathophysiology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.The Institute of Neurosciences，College of Life and Health Sciences，Northeastern University，Shenyang 110015，China）

Objective To investigate the correlation between the rs13266634 C/T SNP of SLC30A8and T2DM in Jinzhou.MethodsBased on case-control study，PCR-HRM was used to identify the genotypes of rs13266634 of SLC30A8gene in 136 cases of T2DM patients and 145 cases of healthy control in Jinzhou.ResultsThe CC genotypic frequency and C allele frequency in T2DM（38.23%and 61.76%）were higher than those of healthy control（22.07%and 51.03%）.Furthermore，there was significant difference in case-control study from the population in Jinzhou（P＜0.05）.The odds ratio of allele C for T2DM was 1.550（95%CI：1.108-2.169，P＜0.05）.ConclusionThe single nucleotide polymorphism of the rs13266634 locusin SLC30A8 gene was correlated with T2DM susceptibility in Jinzhou，and the allele C was a risk allele.

SLC30A8gene；single nucleotide polymorphism；high-resolution melting curve；type 2 diabetes mellitus

R587.1

A

0258-4646（2015）06-0494-04

國家自然科學基金（81170775）

劉陽（1975-），女，主管技師，碩士研究生. E-mail：jykly43@aliyun.com

2015-01-12

網絡出版時間：