MMP7蛋白在百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中的表達及其意義

杜妍，張罡，肖莉

（中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004）

·論著·

MMP7蛋白在百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中的表達及其意義

杜妍，張罡，肖莉

（中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004）

目的探討基質金屬蛋白酶7（MMP7）在百草枯（PQ）誘導的大鼠肺纖維化組織中的表達及意義。方法將48只雄性大鼠隨機分為對照組和PQ模型組，每組各24只，PQ模型組以4 mg/mL PQ稀溶液按14 mg/kg劑量一次性腹腔注射，對照組以等量生理鹽水注射。于建模后7、14、28 d每組分別處死8只大鼠，觀察肺組織病理學變化，測定肺組織羥脯氨酸（HYP）含量，觀察肺纖維化的嚴重程度，采用免疫組化染色和光密度分析觀察肺組織MMP7表達情況。結果實驗動物一般情況：除28 d組有1只大鼠死亡外，其余各組均全部存活至觀察終點。腹腔注射PQ后，PQ模型組大鼠體質量逐漸下降，14 d左右開始回升，至28 d時仍低于鹽水對照組（P＜0.05）。腹腔注射PQ后，模型組大鼠肺系數逐漸增加，并于14 d時達峰值，之后開始回落。PQ模型組大鼠肺組織HYP含量在第7、14、28天時皆高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），且PQ模型組隨染毒時間延長HYP含量亦明顯增加，并于28 d時達峰值。HE染色顯示：PQ模型組大鼠7 d時出現明顯肺泡炎表現，14 d時肺泡間隔膠原纖維增生，28 d時大量肺泡結構破壞、萎陷，膠原纖維廣泛增生。MMP7在對照組大鼠肺組織表達較弱，PQ模型組大鼠肺組織MMP7表達在第7、14、28天時皆高于相應對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論PQ染毒后大鼠肺組織早期以炎性反應為主，成纖維細胞增多，晚期以纖維化為主，MMP7蛋白在PQ誘導肺纖維化大鼠肺組織內的表達隨著肺泡炎或纖維化程度增高而增強，于染毒后28 d時較對照組有明顯變化，提示它們可能是PQ致肺纖維化的標志物。

百草枯；肺纖維化；MMP7

百草枯（1，1，-二甲基-4，4，-聯吡啶二氯化物，paraquat，PQ），是目前使用最廣泛的除草劑之一［1］，對人體有較強毒性。PQ中毒以肺部病變最為嚴重，可導致明顯肺纖維化［2］。PQ的中毒機制尚不完全明確，可能是因為PQ可誘導人體器官和組織內產生大量自由基所致。基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類主要降解細胞外基質（extracellular cell matrix，EMC）成分的蛋白酶，本研究組的前期研究發現PQ誘導肺纖維化大鼠肺組織中MMP3和MMP8表達增強，提示二者可能是肺纖維化的標志物。本研究擬對MMP7的表達與PQ誘導肺纖維化的相關性做進一步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡雄性SD大鼠48只，體質量250～280 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。PQ（99.99%，貨號：856177-1G）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。MMP7抗體（貨號：bs-0423R）購自北京博奧森生物技術有限公司，羥脯氨酸含量測定試劑盒（貨號：A030-3）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組及提取標本：將大鼠飼養1周后隨機分為2組，每組動物24只。（1）PQ模型組：以4 mg/mL PQ稀釋溶液按14 mg/kg給予大鼠一次性腹腔注射；（2）NS對照組：一次性腹腔注射等量0.9%生理鹽水。選擇固定時間測定動物體質量。分別于給藥后7、14、28 d處死動物。去除左肺，-80℃凍存待行肺組織羥脯氨酸含量測定；以4%甲醛溶液對右肺組織進行內固定，以備病理組織檢查及免疫組化染色。

1.2.2 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷：肺組織石蠟切片后行HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。按照Szapiel等［3］的方法評價肺組織病理變化嚴重程度。

1.2.3 肺系數的測定：根據實驗設計，在建模后7、14、28 d時間點，選取大鼠并分離雙肺，稱質量并測定肺系數（pulmonary index），肺系數=肺質量（mg）/體質量（g）。

1.2.4 酸水解法測定肺組織羥脯胺酸含量：取-80℃凍存肺組織標本，研磨均漿后，采用酸水解法測定肺組織羥脯胺酸含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.2.5 免疫組化SABC法檢驗肺組織MMP7蛋白含量：肺組織石蠟切片常規脫蠟，水化，然后按免疫組化試劑盒說明書進行操作。應用NIS.Elements F230圖像采集軟件觀察標本圖片，計算平均光密度（mean optical density，MOD），應用NIS-Elements BR3.0圖像分析軟件，以MOD作為光密度分析的半定量參數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體質量變化分析

NS對照組動物體質量持續增加；PQ模型組動物體質量先有下降，一般在14 d左右逐漸回升，但仍輕于同期對照組。見表1。

表1 2組大鼠體質量變化的比較（，g）Tab.1 Comparison of body weight changes between the two groups（，g）

表1 2組大鼠體質量變化的比較（，g）Tab.1 Comparison of body weight changes between the two groups（，g）

1）P＜0.01 vs NS control group.

Group 0 d 7 d 14 d 28 d NS control 252.61±12.08 272.38±11.15 291.43±10.07 351.43±9.26 PQ model 248.33±11.07 236.32±10.431） 228.69±9.521） 242.41±7.521）

2.2 各組大鼠肺組織的病理學改變

肉眼觀察：對照組大鼠肺組織表面呈粉紅色，質軟富有彈性，表面光滑。PQ模型組大鼠染毒第7天肺組織出現充血，表面出血點增多明顯，部分呈現灶性瘀斑，肺組織腫脹，體積增大，第14天肺組織充血有所減輕，少數肺葉呈現少量瘀血，肺部腫脹減輕，第28天肺組織呈灰白色，體積減小，彈性降低，肺部表面出現凹凸及纖維化瘢痕。

光鏡觀察：對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡壁結構清晰，無明顯充血，水腫及炎癥。PQ模型組造模第7天肺組織水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔內出現滲出，肺毛細管擴張充血，可見中性粒細胞及單核巨噬細胞浸潤。第14天肺泡間隔進一步增寬，水腫部分消退，肺內炎性細胞聚集，膠原纖維增生。第28天肺泡結構明顯增寬，部分塌陷，炎性浸潤緩解減輕，膠原纖維及纖維細胞進一步明顯增生。見表2，圖1。

表2 肺組織纖維化或肺泡炎程度的比較（n）Tab.2 Comparison of lung tissue fibrosis or alveolitis（n）

圖1 各組大鼠肺組織標本HE染色動態變化 HE×200Fig.1 HE staining dynamic changes of the rat lung tissues HE×200

2.3 各組大鼠肺系數的測定

腹腔注射PQ后，隨染毒時間延長肺系數亦有差別，模型組大鼠肺系數明顯增加，于14 d時達峰值，之后有所降低。見表3。

表3 各組大鼠肺系數的變化（）Tab.3 Changes in lung coefficient in each group（）

表3 各組大鼠肺系數的變化（）Tab.3 Changes in lung coefficient in each group（）

1）P＜0.01 vs NS control group.

Group 7 d 14 d 28 d NS control 8.56±0.59 8.31±0.57 8.02±0.52 PQ model 11.31±1.821） 15.37±0.611） 10.15±1.671）

2.4 肺組織羥脯氨酸含量測定

造模后，模型組大鼠肺組織羥脯氨酸含量進行性增高，始終高于同期對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

2.5 免疫組化法檢測MMP7在大鼠肺組織內的含量

PQ組大鼠肺組織中MMP7的表達始終高于同期NS對照組，至28 d時表達最強。見表5，圖2。

表4 羥脯氨酸含量測定結果（，μg/mg）Tab.4 Hydroxyproline content in lung tissues（，μg/mg）

表4 羥脯氨酸含量測定結果（，μg/mg）Tab.4 Hydroxyproline content in lung tissues（，μg/mg）

1）P＜0.05 vs NS control group：2）P＜0.01 vs other time points in the same group.

Group 7 d 14 d 28 d NS control 1.394±0.043 1.402±0.057 1.395±0.064 PQ model 1.687±0.0451），2） 1.906±0.0591），2） 2.725±0.0831），2）

表5 各組標本MMP7平均光密度（MOD）值（）Tab.5 The mean optical density（MOD）value of MMP7 in each group（）

表5 各組標本MMP7平均光密度（MOD）值（）Tab.5 The mean optical density（MOD）value of MMP7 in each group（）

1）P＜0.05 vs NS control group；2）P＜0.01 vs other time points in the same group.

Group 7 d 14 d 28 d NS control 0.304 1±0.030 4 0.307 2±0.025 6 0.311 2±0.032 6 PQ model 0.395 1±0.040 71），2） 0.417 5±0.022 71），2） 0.473 0±0.070 81），2）

圖2 各組大鼠肺組織MMP7表達的免疫組化檢測結果 ×200Fig.2 MMP7 immunohistochemical observation of the rat lung tissues in each group×200

3 討論

PQ在1962年作為除草劑上市后，由于具有遇土迅速失活，不損害植物根部，對環境無污染的特點，已在130多個國家廣泛使用，而我國是最大的生產國和使用國。自1964年愛爾蘭發生了第1例PQ中毒事件以來，PQ中毒日趨增多，已成為繼有機磷農藥中毒之后最常見的農藥中毒。國內報道病死率高達85%～95%，且大多數幸存者存在肺纖維化，預后較差。PQ經多渠道吸收后，通過多胺攝取途徑特異性聚集于肺臟［4］，重度中毒患者可于短期內死于多器官功能衰竭，中度中毒患者于染毒后24 h迅速出現急性肺損傷癥狀，進行性發展為急性呼吸窘迫綜合征，如1周左右患者仍存活，肺部損傷逐漸加重，可發展為不可逆的肺間質纖維化，后期多死于呼吸衰竭［5］。

羥脯氨酸為膠原纖維所特有，占膠原蛋白成分的13%。膠原纖維是肺纖維化的基礎，所以通過測定羥脯氨酸含量可以間接反映膠原含量，可作為衡量膠原代謝的重要指標［6］。

MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內肽酶，已分離鑒別出26個成員。MMPs是降解細胞外基質的最重要的酶系，其中的某些成員是迄今發現唯一能降解膠原纖維的酶［7］。MMPs直接以酶原的形式分泌到EMC中，并在正常生理條件下發揮降解作用。MMPs的這一作用可以預防或引發疾病，已在腫瘤、心腦血管疾病、風濕免疫性疾病等多方面被廣泛研究［8］。MMP7是該家族中最小的成員之一。本研究組的前期研究結果提示MMP3和MMP8可能是肺纖維化的標志物。因此，本研究就MMP7的調節及其在肺纖維化中的作用進行了研究。結果提示，肺纖維化的發生與MMP7的異常表達直接相關，提示MMP7可能是PQ致肺纖維化的標志物。

綜上所述，MMP7伴隨肺纖維化的整體發展過程。MMP7的檢測具有重要的臨床意義，可提示肺纖維化的起始、進展和嚴重程度，從而進一步指導治療，判斷預后。然而，MMPs參與肺纖維化的分子生物學機制尚未明確，有待進一步研究探討。

［1］Roberts DM，Wilks MF，Roberts MS，et al.Changes in the concentrations of creatinine，cystatin C and NGAL in patients with acute paraquat self-poisoning［J］.Toxicol Lett，2011，202（1）：69.

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［3］Tomita M，Okuyama T，Katsuyama H，et al.Mouse model of paraquatpoisonedlungs and its geneexpression profile［J］.Toxicology， 2007，231（2-3）：200-209.

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［7］李苑碧，彭清華，黃學思，等.青光安對抗青光眼術后濾過道瘢痕組織中彈性纖維、MMP-7、TIMP-1的實驗研究［J］.國際眼科雜志，2015，15（1）：20-25.

［8］Elin HO，Bodil F.Regulation of matrixmetalloproteinase activity in health and disease［J］.FEBS J，201l，278（1）：28-45.

（編輯王又冬）

Significance and Expression of MMP7 in Paraquat-induced Murine Pulmonary Fibrosis

DUYan，ZHANG Gang，XIAO Li

（Department of Emergency，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase 7（MMP7）in paraquat（PQ）-induced pulmonary fibrosis in rats.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into the control group and the pulmonary fibrosis model group（PQ model group），each group of twenty-four rats.Rats in the PQ model group received single intraperitoneal injection of 4 mg/mL PQ dilute solution and the control group were intraperitoneal injected with the same dose of saline.Eight rats of each group were sacrificed on day 7，day14 and day 28 respectively.The pathological changes of lung tissues were observed and the hydroxyproline（HYP）content in lung tissues was determined.The severity of pulmonary fibrosis was observed.The expressions of MMP7 in lungs were observed by immunohistochemistry.ResultsThe observation of general state of the experimental animals showed that except one rat died at day 28 d，all other rats survived to the end point of observation.After intraperitoneal injection with PQ，the weight of rats in the PQ model group gradually declined，and then increased around day 14，yet still much lower than that in the control group at day 28（P＜0.05）.After intraperitoneal injection with PQ，the pulmonary index in the model group increased gradually and then decreased after reaching the peak on day 14.The content of HYP in rat lung tissues in the PQ model group was remarkably higher than in the control group at day 7，day 14，and day 28，with statistical significance（P＜0.01）.In the PQ model group，the content of HYP was significantly up-regulated with the extension of infected time and reached the peak value at day 28.The results of HE staining showed significant pulmonary alveolitis at day 7，hyperplasia of abundant collagen fibers in alveolar septum at day 14，and obvious pulmonary fibrosis and collapse of alveolar structure on day 28 in the lung tissues of the PQ model group.A weak expression of MMP7 was measured in the lung tissues in the control group and the expression of MMP7 was higher in the PQ model group than in the control group at day 7，day 14，and day 28，with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionParaquat poisoning was mainly manifested in inflammatory reactions of lung tissues in the early stage together with increase of fibroblasts and mainly in fibrosis in the late stage.The expression of MMP7was increased along with the severity of pulmonary alveolitis or fibrosis and showed significant changes compared to the control group at day 28 after poisoning，indicating that MMP7 may be the marker of paraquat-induced pulmonary fibrosis.

paraquat；pulmonary fibrosis；MMP7

R563.9

A

0258-4646（2015）06-0557-05

杜妍（1984-），女，醫師，碩士研究生.

肖莉，E-mail：xiaoli@sj-hospital.org

2015-05-07

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